[发明专利]一种用于早期肝细胞损伤诊断的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及医疗诊断技术领域，具体为一种用于早期肝细胞损伤诊断的检测方法。

背景技术

肝脏是维持生命存在的最重要的器官之一，是人体内最大的内脏器官，其主要功能涉及物质和能量代谢、生物解毒、生物合成、胆汁分泌、内分泌和免疫等。任何原因引起的肝损伤均会不同程度地影响肝脏的这些功能，同时引发其他组织器官的功能障碍。

在当前临床应用中，有关肝脏生化检测项目及全自动生化仪器的应用逐渐普遍。其中，肝细胞损伤和损伤程度常根据SALT（血清丙氨酸氨基转移酶）、SAST（血清天冬氨酸氨基转移酶)来判定。ALT存在于肝细胞浆中，为其细胞内外浓度比为5000：1，细胞膜破裂或变形时，ALT大量进入血液中。研究发现1%的肝细胞坏死时，血清ALT水平即可升高1倍。AST主要分布于心肌，其次是肝脏、骨骼肌和肾脏等组织中。由于大约80%的AST存在于线粒体内，所以对肝细胞损伤的敏感度不如ALT，升高的幅度也不如ALT大。但是，当AST持续升高，数值超过ALT，往往提示肝实质损害严重，是慢性化程度加重的标志。因此，ALT和AST主要对中晚期肝细胞膜损伤最为敏感，对肝细胞膜早期损伤覆盖不全，需要新的诊断标准物辅助诊断。

一项药理研究发现，注射CCl₄的小鼠，SGR（血清谷胱甘肽还原酶）在6 h达到峰值，SAST和SALT在24 h达到峰值；36h后SGR基本降至正常水平，SAST、SALT远远超过正常水平。表明在急性肝损伤模型中SGR比SAST、SALT更早增加更快减少，敏感性更高。另一项临床研究也发现，急性肝炎早期阶段，所有患者SGR异常升高。

谷胱甘肽还原酶（GR）主要存在于线粒体和细胞液中。人体内GR活性强弱依次为肝、肾、胰、心、甲状腺、红细胞和血浆。可以及时清除人体代谢过程中产生的氧自由基（OFR），是维持细胞中还原型谷胱甘肽（GSH）含量的主要黄素酶；对保护巯基蛋白和酶的天然活性，肝细胞膜的完整性具有重要价值。并且，GR活性上升很小。在肝炎情况下，GR也很少能达到正常值（0.18-0.61/μmol serum/h）上限的3倍；而对于正常人而言，GR的活性浮动也很小，小到轻微的偏差也能帮助做出诊断。因此，在多种肝病类型中，GR显著升高，具有临床诊断意义。

此外，GR除了应用肝脏疾病以外，在其他疾病中也具有临床诊断价值。例如，急性传染性病人SGR活性常在第一周开始升高，可高于对照值1倍以上，并随黄疸加深而增高，待黄疸达峰值后一周内恢复正常；恶性肿瘤患者SGR升高的阳性率为35%～80%，以白血病及骨发生继发性肿瘤者活性最高，而良性肿瘤患者SGR活性不增；未经治疗的急性白血病及慢性粒细胞性白血病患者的SGR活性，多超过对照值3倍以上；在先天性缺乏G-6-PD（葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）患者中，其红细胞GR活性高于对照值2倍以上。

发明内容

本发明的目的在于提供一种灵敏度高、稳定性好的用于早期肝细胞损伤诊断的检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于早期肝细胞损伤诊断的检测方法，包括以下步骤：

S1：样品准备，包括有新鲜不溶血的血清、含抗凝剂的血浆和红细胞裂解液三种；

S2：试剂盒准备，包括有空白管、校准品管、样本管、蒸馏水、校准品、样本、R1试剂和R2试剂；

S3：样品测定，包括如下步骤：

S3.1：依次取空白管加入8μl的蒸馏水、取校准品管加入8μl的校准品、取样本管加入8μl的样本；

S3.2：分别向S3.1中的空白管、校准品管、样本管中添加R1试剂混合均匀，置37℃孵育300s；

S3.3：再向添加R1试剂后的空白管、校准品管、样本管中添加R2试剂混合均匀；

S3.4：将添加R2试剂后的空白管、校准品管、样本管置37℃孵育60s后，在340nm波长处，每隔20 s读取吸光度，连续读数120s，计算平均变化率△A/min；

S4：计算样品中GR活力值，包括血清、血浆样本值和红血球样本值。

优选的，针对S1中红细胞裂解液样品准备包括以下步骤：

S1.1：用抗凝管收集血液，颠倒混匀；

S1.2：取0.5ml全血，2000rpm离心5min，弃上清，去除血浆；

S1.3：用0.9%氯化钠悬浮清洗沉淀，2000rpm离心5 min，弃上清，去除0.9%氯化钠，重复悬浮清洗3次；