[发明专利]基于数字PCR的基因突变筛查方法和试剂盒、基于数字PCR的基因突变筛查系统

说明书

技术领域

本发明属于生物医疗技术领域，具体地，涉及利用数字PCR对肿瘤相关基因突变进行大规模筛查的方法和试剂盒、基于数字PCR的基因突变筛查系统。

背景技术

数字PCR(Digital PCR-dPCR)通过将荧光定量PCR反应体系分散为成千上万个微体积单元，逐个检测每个微体积单元热循环后的荧光信号并计数，结合泊松分布原理进行统计学分析，即得到样本中待测核酸分子的拷贝数或浓度。与传统的荧光定量PCR相比，数字PCR直接检测目标序列的拷贝数，实现真正意义上的绝对定量，检测过程无需对照样品和标准曲线，具有前所未有的灵敏度、准确性、特异性和精确性。

目前数字PCR用于检测基因突变时，都是针对某个特定突变序列，设计相应的荧光标记探针序列，根据数字PCR结果判定有无该突变以及含量高低。如专利CN 105624309A公开了一种检测EGFR和/或K-ras基因突变的引物、探针及试剂盒，该检测方法中是针对多种固定的基因序列的探针，尤其固定的基因突变进行的检测。

当待测样本包含多个突变序列时，需要针对每个突变序列设计相应的探针。受限于探针标记荧光染料的种类和光谱学特征，数字PCR能够同时检测的序列数量受到限制。更重要的是，探针法只能检测已知突变序列，不能检测未知突变序列。因此，发明能够同时检测多种未知序列的方法，对于扩大数字PCR的应用，特别是在肿瘤筛查领域的应用非常重要。

发明内容

本发明为克服现有数字PCR检测方法难以检测未知突变序列以及能够检测的突变序列数量较少的问题，提供一种简单、成本低廉、可检测多个未知序列的方法。

为解决上述问题，本专利的技术方案如下：

本发明第一方面提供了一种基于数字PCR的基因突变筛查方法，该方法包括以下步骤：

(1)准备含有待测基因的DNA样本；

(2)数字PCR扩增：体系包括DNA样本、引物、数字PCR mix、荧光染料和荧光标记探针混合，用数字PCR系统扩增；

(3)收集信号并进行结果判断：对PCR扩增反应后的产物进行信号收集，根据荧光信号的类型判断待测样品中是否含有发生基因缺失突变的DNA以及突变基因的含量。

在本发明一实施方式中，所述DNA样本由外周血或者肿瘤组织提取所得

在本发明一实施方式中，所述引物可以特异扩增待测基因。具体地，扩增产物覆盖荧光标记探针的结合位点。

可以理解的是，本领域技术人员可以根据本领域常规知识针对待测基因设计出特定引物用于数字PCR。

在本发明一实施方式中，所述数字PCR mix包括但不限于各种数字PCR mix商品化试剂盒(比如Bio-Rad ddPCR^TM Supermix for Probes,#186-3026,#186-3027,#186-3010,#186-3028)。

在本发明一实施方式中，所述荧光染料和PCR扩增所得DNA双链产物结合后可发出强烈荧光的嵌入式荧光染料。

在本发明一优选实施方式中，所述荧光染料选自Evagreen(Biotium,Evagreen dye,20x in water,#31000)、Sybrgreen(Solarbio,SYBR Green I(10000×),SY1020-50ul,SY1020-100ul,SY1020-1ml)、LC Green Plus(Biofire,LC Green Plus,#BCHM-ASY-0005,#BCHM-ASY-0006)中的一种或几种。

在本发明一种优选方案中，所述荧染料为Evagreen染料(绿色荧光)。