[发明专利]SPKP‑XI在制备Kv4.2通道抑制剂中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种活性多肽在离子通道工具试剂中的用途，尤其是用化学法制备的广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钾肽-XI（简写为SPKP-XI）在制备电压门控钾通道亚型工具试剂-Kv4.2通道抑制剂中的用途。

背景技术

电压门控钾通道广泛分布于神经元、心肌、血管平滑肌、胰腺、骨骼肌等可兴奋性组织中，是一种重要的跨膜结构蛋白，其参与调节神经递质的分泌、血管收缩、胰腺分泌和骨骼肌兴奋性等多种生理过程,同时也是治疗药物作用的重要靶标之一。钾离子通道的结构与功能关系研究已经成为国际上的研究热点。Kv4.2钾通道属于瞬时外向钾通道，在大脑、心脏、肺和平滑肌中高表达，它是动作电位复极化早期外向电流的主要成分，在调节神经元放电频率和心肌兴奋收缩耦联等方面起重要作用。Kv4.2钾通道很可能成为神经性和心血管等疾病的重要治疗靶点。很显然，借助Kv4.2钾通道的特异性调制剂对这些研究的深入开展是非常必要的。通过阐述这些特异性调制剂作用于钾通道的分子机制，除了在理论上可深入推测Kv4钾通道亚型之间的功能活动区别和门控活动机制外，还可以为将它们开发成治疗人类相关疾病的新药提供充分的理论基础和广阔的应用前景。自然界的动物毒素是一类具有很高实用价值和应用前景的工具试剂或药物导向物质，不仅是有毒动物抵御天敌的有力武器，也是从事神经生物学和生理学研究、天然创新药物开发以及蛋白质基础研究的宝贵材料,同时也是研究离子通道的独特“分子探针和解密器”。

发明内容

本发明旨在于提供一种广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钾肽-XI在制备电压门控钾通道亚型工具试剂-Kv4.2通道抑制剂的应用，所述的广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钾肽-XI（简写为SPKP-XI），其氨基酸序列为：

NH₂-Glu Cys Arg Lys Met Phe Gly Gly Cys Ser Val Asp Ser Asp Cys Cys Ala His Leu Gly Cys Lys Pro Thr Leu Lys Tyr Cys Ala Trp Asp Gly Thr Phe-NH₂，其特征在于广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钾肽-XI作为单一有效活性组份用于制备Kv4.2通道抑制剂。

所述的蜘蛛抑钾肽-XI的N端第2位半胱氨酸和第16位半胱氨酸之间，N端第9位半胱氨酸和第21位半胱氨酸之间，N端第15位半胱氨酸和第28位半胱氨酸之间分别形成二硫键。

该蜘蛛抑钾肽-XI作为单一有效活性组分用于制备Kv4.2通道抑制剂，以细胞外给药的方式制备成Kv4.2通道工具试剂。

蜘蛛抑钾肽-XI在制备Kv4.2通道工具试剂或抑制剂时，配制细胞外给药的剂量为5 μmol/L。

蜘蛛抑钾肽-XI对Kv4.2通道的抑制呈现时间依从性和可逆性，是一种较好的Kv4.2钾通道工具试剂。

附图说明

图1是SPKP-XI对表达于爪蟾卵母细胞的Kv4.2钾通道亚型的影响。

图2是SPKP-XI对表达于爪蟾卵母细胞的Kv1.1钾通道亚型的影响。

图3是SPKP-XI对表达于爪蟾卵母细胞的Kv1.2钾通道亚型的影响。

具体实施方式

为了更好的理解和更充分公开本发明，下面将通过细胞外给药途径，采用非洲爪蟾卵母细胞模型来说明蜘蛛抑钾肽-XI的Kv4.2通道抑制作用。

1、实验材料和方法

1.1通道质粒的扩增和提取

采用promega公司的质粒提取试剂盒（Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System）。

溶液的配方如下：

细胞重悬液细胞裂解液

Tris-HCl (pH 7.5) 50mMNaOH 0.2M

EDTA10mM1% SDS

RNase A 100µg/ml

中和液洗脱液

盐酸胍4.09M 乙酸钾 60mM

乙酸钾0.759MTris-HCl (pH 7.5) 8.3mM

冰醋酸2.12M EDTA 0.04mM

pH为4.2 加入95% 乙醇 ,终浓度为60%乙醇

操作步骤：

Ø 收集菌液（4℃，12000r/min，离心 1min）

Ø 弃上清，用滤纸吸干残留在管壁的溶液，加入250μL细胞重悬液，充分混匀