[发明专利]具有高杀伤力的自然杀伤性细胞高效体外扩增培养方法

权利要求书

1.具有高杀伤力的自然杀伤性细胞高效体外扩增培养方法，其特征在于：具体的培养方法为：步骤一、配置培养基，每100mL MEM-a培养基加入5mL血浆，加入IL-2 10U/mL，IL-15 100U/mL，IL-21 10U/mL，以及SCF 50ng/mL，包被培养瓶，将纤黏蛋白用PBS或生理盐水稀释至0.1mg/mL，吸取5mL加入10cm培养皿中，在4℃包被过夜后，将残留液体吸出，待用；

步骤二、取样：取5mL-10mL静脉血或者脐血，活率≥90％，用于制备单个核细胞，取5mL-10mL淋巴细胞分离液，小心转移静脉血至分离液之上，轻柔操作避免打破交界液面，在1800r/min下，离心15min，吸取上层液体即血浆层，用于后期细胞培养，小心吸取中间白膜层，即单个核细胞层，转移至新离心管中；

步骤三、单个核细胞用500U/mL双抗的PBS，400g离心10min，充分漂洗3遍，接种在0.1mg/mL纤黏蛋白铺底的10cm培养皿中，将分离获得的单个核细胞按1.0-2.0×10⁶个/mL的浓度接种于包被过的细胞培养皿中，放置在37℃下，5％的CO₂的饱和湿度的培养箱内培养；

步骤四、第2-6天，观察培养基颜色并计数，每2-3天补加新鲜培养基，含5％自的体血浆，调整NK细胞密度为1.0-2.0×10⁶个/mL；

步骤五、第7天后，可将自体血浆含量降低1％，根据细胞培养悬液体积选择扩瓶，T75培养瓶最大体积40mL，T175培养瓶最大体积200mL，利用流式细胞术检测CD3^-CD56⁺细胞比例，此类细胞为NK细胞；

步骤六、纯化NK细胞，每10⁷细胞加入90μL PBS.加入10μL CD56Micro Beads，混匀，4-8℃，15min，此后，加入1-2mL PBS，在1500r/min，4℃离心5min,弃上清，每10⁸细胞用500μL PBS重悬，将LS/MS柱子安装到磁铁上，加入3mL PBS，重力作用自然流尽，将细胞液加入到柱子中，用3mL PBS洗脱三次，利用LS/MS柱子活塞，推出结合在磁珠上的细胞，为纯化的CD56⁺NK细胞；

步骤七、利用无血清冻存液将纯化的CD56⁺NK细胞冻存于液氮中。