[发明专利]促进3β-HSD基因表达的表达载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种组合物在制备抗肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所述抗肿瘤的药物为抗乳腺癌的药物，所述组合物包括：

促进3β-HSD基因表达的表达载体，所述促进3β-HSD基因表达的表达载体为慢病毒表达载体，所述促进3β-HSD基因表达的表达载体包括慢病毒载体pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列以及目的基因表达片段，所述多克隆位点包括EcoRI酶切位点和NotI酶切位点，所述目的基因表达片段中含有用于表达3β-HSD的3β-HSD基因编码序列，所述目的基因表达片段的5’端具有EcoRI酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段的3’端具有NotI酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段正向插入在所述多克隆位点序列的所述EcoRI酶切位点和所述NotI酶切位点之间，所述3β-HSD基因编码序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

或者，含有3β-HSD基因的慢病毒，所述含有3β-HSD基因的慢病毒通过如下方法制备得到：将促进3β-HSD基因表达的表达载体转染进入293FT细胞中；以及对转染后的所述293FT细胞扩增表达，获得所述含有3β-HSD基因的慢病毒，其中，所述促进3β-HSD基因表达的表达载体包括慢病毒载体pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列以及目的基因表达片段，所述多克隆位点包括EcoRI酶切位点和NotI酶切位点，所述目的基因表达片段中含有用于表达3β-HSD的3β-HSD基因编码序列，所述目的基因表达片段的5’端具有EcoRI酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段的3’端具有NotI酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段正向插入在所述多克隆位点序列的所述EcoRI酶切位点和所述NotI酶切位点之间，所述3β-HSD基因编码序列的核苷酸序列如SEQID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述EcoRI酶切位点黏性末端的3’端直接与所述3β-HSD基因编码序列的5’端连接，所述NotI酶切位点黏性末端的5’端直接与所述3β-HSD基因编码序列的3’端连接，所述EcoRI酶切位点黏性末端的碱基序列为5’-aattc-3’，所述NotI酶切位点黏性末端的碱基序列为5’-ggccgc-3’。

3.根据权利要求1或者2所述的应用，其特征在于，所述促进3β-HSD基因表达的表达载体通过如下构建方法构建得到：

以3β-HSD基因编码序列作为扩增模板，并加入上游引物和下游引物后进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，所述上游引物包括针对所述3β-HSD基因编码序列的5’端设计的序列和针对EcoRI酶切位点设计的序列，所述下游引物包括针对所述3β-HSD基因编码序列的3’端设计的序列和针对NotI酶切位点设计的序列；

对所述PCR扩增产物进行加A尾反应，使得所述PCR扩增产物的两端连接A碱基，并将加A尾反应后的所述PCR扩增产物连接到T载体中，得到重组T载体；

用限制性内切酶EcoRI和限制性内切酶NotI对所述重组T载体进行双酶切，得到目的基因表达片段；以及

将所述目的基因表达片段连接到经过限制性内切酶EcoRI和限制性内切酶NotI双酶切处理后的慢病毒载体pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro中，得到所述促进3β-HSD基因表达的表达载体。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述上游引物的碱基序列如SEQ ID No.2所示，所述下游引物的碱基序列如SEQ ID No.3所示。