[发明专利]一种通过枝干截面愈伤不定芽再生纯化嵌合体获得纯四倍体冬枣植株的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植株的繁育方法，具体涉及一种通过枝干截面愈伤不定芽再生纯化嵌合体获得纯四倍体冬枣植株的方法。

背景技术

枣原产中国，是中国最具特色和优势的果树树种之一，栽培面积近3000万亩，产量多600万吨，占世界99%。近年来，随着枣产业的发展，栽培品种结构不断调整优化，鲜食枣的栽培越来越受到重视。‘冬枣’是目前我国第一大主栽优良鲜食枣品种，除了山东沾化以外，在河北、山西和陕西等地也都形成了一定的规模。但‘冬枣’果个偏小、栽培管理要求高，进行‘冬枣’遗传改良不仅是‘冬枣’，也是当前鲜食枣产业发展的必然需要。

果树多倍体常表现出果实巨大性等优良性状，在果树育种中一直受到高度重视。枣树的多倍性育种开始于20世纪70年代末期，但枣树人工诱变多倍体常常是获得嵌合体，嵌合体纯化仍是枣树人工多倍体诱变中需要面对的重要问题。当前田间大面积种植的‘沾冬2号’是源自‘冬枣’自然变异的倍性嵌合体材料（二、四混倍体），其生长特性不稳定，‘冬枣’果实偏小，枝条中每年会出现相当比例的二倍体‘冬枣’，并且其抗性低，近几年冻害严重，这增加了管理难度，降低了收益，严重影响了枣农的推广积极性，限制了该品种的推广发展。在枣树倍性种质创新中，已有人工诱变、胚乳培养获得多倍体的报道，但自然芽变倍性嵌合体的纯化研究尚未见报道。能否通过自然芽变倍性嵌合体的纯化，纯化嵌合体‘沾冬2号’获得四倍体冬枣，实现‘沾冬2号’的多倍化改良和换代升级，是目前行业内亟需解决的技术问题。

发明内容

为了解决以上现有技术中的问题，本发明创造性的提出一种通过枝干截面愈伤不定芽再生纯化嵌合体获得纯四倍体冬枣植株的方法，该方法通过自然芽变倍性嵌合体的纯化得到四倍体冬枣植株，无需像离体组培那样经历过渡培养、温室栽培、移栽下地等过程，可直接移栽入大田，具有可以进行再生材料田间快速评价的优势，提高了‘沾冬2号’的纯化效率，加速获得纯四倍体冬枣。

本申请采取的技术方案如下：

（1）从5月中旬到8月中旬选择健壮‘沾冬2号’冬枣枝干，进行截枝处理，在截面上放一圈脱脂棉覆盖形成层，用含有细胞分裂素的药剂润湿脱脂棉，用塑料袋包住截口并系紧，12-14h后，去除覆盖物，并用湿泥覆盖截口，再覆盖塑料布系紧保湿，进行愈伤组织和丛生芽诱导。

（2）诱导植株的倍性鉴定：叶形指数，节间作为指标进行形态学上的鉴定，利用常规压片法鉴定诱导植株的染色体数目，利用荧光显微镜观测保卫细胞叶绿体数目，气轧大小及密度，利用流式细胞仪检测诱导植株细胞的DNA含量，区分为纯四倍体枝条或纯四倍体枣树苗。

（3）纯四倍体枣树苗经过继代、生根培养后，移栽入大田纯四倍体种植园；将步骤（2）中得到的纯四倍体枝条采接穗嫁接到性状稳定纯合四倍体优株或优枝上。

（4）进行四倍体植株的盆栽抗性试验、大田抗性试验，选择抗性水平高、性状优良的株系，果实品质的测定，从而选育出优良的四倍体冬枣苗木。

其中以上步骤（3）中继代、生根培养步骤为：将鉴定后的纯四倍体枣树苗培养新抽出的芽梢剪成1-2cm的茎段，茎段保留一节以上，转接到MS＋BA1.5＋IBA0.5继代培养基上，将后续培养形成的芽梢反复转接不断的分化增殖；将继代培养基上的芽梢剪成1cm带1-2节的茎段，接到生根培养基上培养，试管苗茎段根长达到2cm以上后，脱瓶移栽入大田苗圃。

其中以上步骤（2）中得到的纯四倍体枝条采接穗嫁接到性状稳定纯合四倍体优株或优枝上，进行多倍体植株的盆栽抗性试验、大田抗性试验，选择抗性水平高、性状优良的株系。。

其中以上步骤（4）中果实品质的测定方法为：对抗性水平高、性状优良的株系进行果实品质的测定，果实硬度利用GY-1型圆盘硬度计测定，果实的可溶固形物含量利用ATAGO数字折射计PRl测定，果实维生素C含量采用差分分析分光光度计法测定，果实的大小和重量测定，果核的有无，从而选育出优良的四倍体冬枣苗木。

本申请所述的‘沾冬2号’冬枣树为二、四倍体嵌合体。

本发明的有益效果为：本申请通过自然芽变倍性嵌合体的纯化得到四倍体冬枣植株，无需像离体组培那样经历过渡培养、温室栽培、移栽下地等过程，可直接移栽入大田，具有可以进行再生材料田间快速评价的优势，提高了‘沾冬2号’的纯化效率，加速获得纯四倍体冬枣。