[发明专利]一种羊肚菌菌株老化的鉴定方法

权利要求书

1.一种羊肚菌菌株老化的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）菌株活化：将待测菌株活化培养，待用；

2)平皿制备：平皿倒入固体培养基，培养基冷却凝固后，铺一层无菌的玻璃纸；

3)接种：在玻璃纸的一侧距离平皿远缘一定距离，接种活化的菌种块；

4)培养和观察：培养，避免菌丝前端长到平皿的边缘；培养2.5~3d的菌落用于记录菌丝生长速度以及显微观察；培养两周的平皿用于观察记录菌落形态；

5)制片：将玻璃纸揭开，剪取附带有玻璃纸的菌落前端的区域，进行显微观察；

6)观察：观察菌落菌丝尖端的形态；

7)测量：测量菌丝的分支夹角；

8)结果分析：根据观察和测量结果进行菌丝生长阶段分析。

2.根据权利要求1所述的一种羊肚菌菌株老化的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）菌株活化：将待测菌株接入新鲜的灭过菌的CYM培养基，培养基组成为：葡萄糖 20g，蛋白胨 2g，酵母粉2 g，磷酸二氢钾 0.46 g，磷酸氢二钾 1 g，硫酸镁 0.5 g，琼脂粉 20 g，水1000 mL，pH自然；在试管中进行活化，培养温度为23 ~ 25℃，培养5~7d待菌丝长满试管后，作为后续检测的菌种使用；

2）平皿制备：取直径9 cm的平皿，灭菌后使用，无菌条件下，在平皿中倾倒12 ~ 15 mL CYM固体培养基，待培养基冷却凝固后，铺一层无菌的玻璃纸，玻璃纸呈圆形，直径略小于平皿直径；

3）接种：在玻璃纸的一侧距离平皿远缘0.5 ~ 1 cm距离，接种直径约0.5cm的活化好的菌种块；

4）培养和观察：将平皿置于23℃恒温培养箱内避光培养，培养时间控制在2.5 ~ 3 d内或14 d，避免菌丝前端长到平皿的边缘；培养2.5~3d的菌落用于记录菌丝生长速度以及进行显微观察；培养两周的平皿用于观察记录菌落形态，包括菌落的颜色；

5）制片：用镊子小心的将玻璃纸揭开，用剪刀小心的剪取附带有玻璃纸的菌落前端的区域，置于滴加有10% ~ 20%甘油的载玻片上，再在玻璃纸上的菌丝上滴加一滴10% ~ 20%甘油水溶液，盖上盖玻片，进行显微观察；

6）观察：先用4×镜头粗调对焦，之后用10×、20×、40×镜头观察菌落菌丝尖端的形态，并拍照记录；

7）测量： 根据拍照结果，通过软件自带的测量软件或测角器进行菌丝分支夹角的测量，测量数量不少于30个，求均值；

8）菌落形态分析

健壮菌丝阶段：菌落绒毛辐射状，菌丝粗壮，生长迅速，平均长速达0.35 ~ 0.5 mm/h，边缘整齐，7 ~ 10 d后产生色素，不同菌株产色素情况不同，每个菌株或品种之间有较大的差异；

前老化阶段：菌落绒毛辐射状，菌丝较粗壮，生长速度与前一阶段相似，边缘较整齐，产生色素比前一阶段提前3 ~ 5 d；

老化阶段：菌落绒毛状，菌丝细弱、弯曲，生长速度下降，0.15 mm/h至停止生长，边缘不整齐。