[发明专利]一种通过酶解法检测双壳类生物软组织中微塑料含量的方法

说明书

技术领域

本发明属于微塑料检测领域，特别涉及一种通过酶解法检测双壳类生物软组织中微塑料含量的方法。

背景技术

塑料因其高稳定性、持久性和耐腐蚀性得到广泛使用，而大量的塑料使用和排放给环境带来日益严重的污染，尤其是小尺寸塑料垃圾。微塑料(Microplastics，MPs)是指粒径小于5μm的塑料颗粒、碎片、纤维等，来源于工业原始塑料材料、个人护理品或由大粒径塑料降解而来。无脊椎动物(甲壳类、双壳软体类、多毛环节类)、脊椎动物(海鸟、海鱼)甚至哺乳动物(鲸鱼)都能摄入MPs，并且MPs能通过食物链从低营养级传递到高营养级，从而对生态环境产生不利影响。

MPs的广泛存在和潜在危害引起了全世界范围的研究热潮，而双壳类生物作为海洋中常见的生物类群，因为其迁徙范围小，其体内MPs含量的高低经常被一些科研机构用来作为特定海域中MPs污染程度的参照物。MPs的定量分析方法主要流程是将双壳类软组织消解，提取其中的MPs，然后通过量化分析方法得出MPs含量。其中软组织的消解主要应用的是酸碱法，通过强酸或强碱的水溶液对双壳类软组织进行消解，这种方法成本较低，材料易得，但是其强酸或强碱在使用过程中危险系数较高，而且现有的研究发现，部分MPs在强酸或强碱之中理化性状会发生转变，甚至发生MPs消解现象，使得MPs的量化过程受到影响，结果误差较大。现有的研究中也有采用蛋白酶对软组织进行消解的实验，但是采用的是蛋白酶K作为消解底物，这种蛋白酶常用于科研中DNA的提取研究，其价位较高，配置操作复杂，这些都成为酶消解方式没有得到广泛使用的障碍。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种通过酶解法检测双壳类生物软组织中微塑料含量的方法，该方法不会对微塑料的理化性质和形态产生影响，能够对双壳类生物软组织中的微塑料进行准确定量分析，为目标生物生存环境中微塑料污染状况提供科学参考。

本发明的一种通过酶解法检测双壳类生物软组织中微塑料含量的方法，包括：

(1)采集正常生命状态的双壳类生物，清洗后制成软组织样品；

(2)配制酶解液；将2-10g的软组织样品置于活力为8.4uhb/ml-16.8uhb/ml酶解液中50-60℃消解12-24h，得到软组织消解液；对软组织消解液进行真空过滤，过滤完成后干燥，通过立体显微镜进行计数，计算得出微塑料含量。

所述步骤(1)中的双壳类生物为生长年限不少于1年的成熟个体。

所述步骤(1)中的双壳类生物预先在-20℃环境下冷冻，在使用前室温下解冻至少2小时。

所述步骤(2)中的酶解液所用的酶为corolase7089(CAS号:9001-92-7)(工业级)。

所述步骤(2)中的真空过滤采用0.8μm硝酸纤维滤膜或1.6μm玻璃纤维滤膜。

所述步骤(2)中的干燥温度为60-80℃，干燥时间为24-36h。

所述步骤(2)中的计算方法为：得到微塑料计数数量后将微塑料计数数量减去空白对照中微塑料数量，得实际微塑料含量；除以软组织重量，得每单位重量中微塑料含量，公式即为(计数数量值-空白值)/软组织重量；将多个平行重复实验中得到的数据进行整理，去除偏差较大的数据，得到平均值作为最终微塑料含量。

操作人员在制备过程中穿棉质非人工纺织材质服装。

消解及干燥过程中，盛放样品的容器密封保存。

有益效果

目前对生物软组织微塑料监测的前期处理方面主要以酸、碱方式处理，但是酸、碱会对影响部分MPs的理化性质，导致MPs检测出现较大，软组织酶处理方式有研究显示使用蛋白酶K进行试验，但是蛋白酶K价位较高，在使用过程中需要缓冲液处理，操作不简便，因此并没有被业界大规模的广泛采用。

本发明所使用的corolase7089是一种工业级中性蛋白酶，它可以在没有缓冲剂的情况下直接在水中使用，在pH6-9的范围内都具有较高的活性，且价位比科研机构使用的蛋白酶便宜很多，在工业上应用广泛，被大量应用在食品、饲料、化妆品、营养保健品等蛋白质水解处理工作中。本发明通过使用蛋白酶corolase7089解决了酶处理方式的成本高和难操作的问题，且不会对微塑料的理化性质和形态产生影响，能够对双壳类生物软组织中的微塑料进行准确定量分析，为目标生物生存环境中微塑料污染状况提供科学参考。

附图说明

图1为本发明的工艺流程图。

具体实施方式