[发明专利]金银双金属三维有序大孔结构作为SERS基底用于心肾综合征多种蛋白质同时检测

权利要求书

1.一种基于金银双金属三维有序多孔基底的SERS生物传感器的制备方法，所述SERS生物传感器由功能化标记的纳米探针和金银双金属三维有序多孔SERS基底构成，其特征是包括如下步骤：

步骤1.功能化标记的纳米探针的制备

在17.4ml二次水中加入0.2mL 20Mm/L的硝酸银溶液，快速搅拌下加入0.6mL 30mM二水合柠檬酸钠溶液，快速加入0.2mL冰浴条件下新制的100Mm/L的硼氢化钠溶液，25℃条件下反应1h，室温敞口避光陈化2小时，得到银纳米粒子溶胶；在10ml 0.01Mm/L的CTAB溶液中加入0.435mL 1％的氯金酸溶液，快速搅拌下加入0.162mL 10Mm/L的硝酸银溶液和0.17mL0.1M/L的抗坏血酸溶液，溶液变为无色后，加入上述制备的银纳米粒子溶胶0.5mL，溶液变为浅蓝色后，快速搅拌，继续反应4h，5500rpm离心10min分离后，用二次水洗2次，最后分散在5mL二次水中，得到Ag@Au nanostar溶胶，在溶胶中加入10μL 0.3mM/L的HS-PEG-COOH水溶液和0.5mL 1Mm/L 4-MBA乙醇溶液，25℃磁力搅拌4小时，离心洗涤两次，分散在5mL PBS缓冲液中，得到Ag@Au NS@PEG-COOH/4-MBA纳米粒子；取100μL Ag@Au NS@PEG-COOH/4-MBA粒子，用EDC/NHS室温活化30min，加入30μL浓度为60μg mL^-1的标记抗体，4℃反应12h，用PBS离心-分散洗涤两次，除去没有连接上的抗体，再将探针分散在100μL PBS中，得到Ag@AuNS@4-MBA@Ab₂纳米探针；

步骤2.金银三维有序多孔SERS传感基底的制备

首先利用过硫酸盐引发无皂乳液聚合的方法制备聚苯乙烯微球PSM用于组装有序模板；制备前，将苯乙烯用浓度为1M的NaOH溶液洗涤三次,称取10g苯乙烯加入140mL二次水中，在氮气保护下，70℃水浴中机械搅拌10min，接着加入0.23g过硫酸钾溶于10ml二次水的溶液，继续搅拌反应24h，PSM的直径可通过反应时间控制，将得到的白色乳状液自然冷却到室温，得到直径为600nm的单分散聚苯乙烯微球PSM；利用垂直沉积法在ITO电极表面沉积PSM模板，方法如下：将ITO电极分别用丙酮、无水乙醇、异丙醇超声洗涤15min，晾干备用；沉积前，再用无水乙醇将ITO电极超声洗涤10min，氮气吹干，将PS微球乳液稀释至0.2wt％，超声30min，随后将ITO电极垂直插入乳液中，在45℃下静置48h，得到PSM球紧密有序排列的ITO电极；

接着，利用电沉积法在ITO电极上沉积金/银，首先利用循环伏安法在垂直沉积了PSM的ITO电极表面沉积一层薄薄的金层，以PH 9.4的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液为电解液，配制1mM氯金酸溶液，使用CHI 660D电化学工作站，三电极体系：ITO电极为工作电极，饱和甘汞电极(SCE)为参比电极，铂电极为对电极，氮气保护下，电压范围为-1.1V到-0.1V，扫描速度25mV/s，扫描段数为4段，然后通过电流—时间(i-t)曲线电沉积银基底，使用CHI 660D电化学工作站，三电极体系：ITO电极为工作电极，银电极为参比电极，铂电极为对电极，以pH5.5的0.1M硝酸钠溶液为电解液，硝酸银的浓度为5mM，沉积电位为-0.3V，氮气氛围下工作，通过控制电荷消耗量来控制沉积银的厚度，电沉积后，将ITO电极浸泡在四氢呋喃中过夜，使PSM模板溶解，二次水洗涤两次后，室温干燥得到金/银三维多孔结构，最后，利用离子溅射沉积法在银基底表面喷镀一层金膜，金膜厚度由喷镀时间控制；

将多孔基底浸入0.3mM HS-PEG-COOH溶液中室温反应4h，用二次水洗涤两次后，用EDC/NHS室温活化30min，滴加10μL 60μg mL^-1的包被抗体，4℃反应12h，用PBS冲洗两遍洗去未连接上的抗体，即完成金银三维有序多孔SERS传感基底的制备；

上述的功能化标记的纳米探针和金银三维有序多孔SERS传感基底构成SERS生物传感器。

2.一种权利要求1所述制备方法制备的SERS生物传感器。