[发明专利]用于肝细胞分离实验的灌流液灌注方法

说明书

本发明公开了用于肝细胞分离实验的灌流液灌注方法，其包括：在肝组织块的表面选出多个穿刺区，每个所述穿刺区内选取至少三个穿刺点用于灌注灌流液；在所述穿刺点的位置将注射器的注射口刺入所述肝组织块，并匀速灌注前灌流液，直至所述肝组织块由暗红色逐渐变为灰白色且流出的前灌流液变清亮；再用注射器在所述穿刺区刺入所述肝组织块，并匀速灌流后灌流液，直至所述肝组织块变疏松、失去弹性，且表面呈龟背状裂隙；停止灌流，至此灌注完成。本发明提供的灌流液灌注方法，通过在肝组织块表面选取多个穿刺区上灌注灌流液，一方面其操作简单，另一方面，还使肝细胞分离实验不再受肝组织块大小和肝组织块内的血管完整度的限制。

【技术领域】

本发明涉及细胞分离培养领域，尤其涉及一种用于肝细胞分离实验的灌流液灌注方法。

【背景技术】

以培养肝细胞为生物成分的生物人工肝成为治疗急性肝衰竭的有效手段。随着该研究的深入，迫切需要理想的肝细胞来源与分离、培养技术，尤其是人原代肝细胞。

目前，肝细胞的分离多采用离体两步胶原酶灌注法，并且通常是从肝脏的门静脉灌入灌流液，灌注结束后剪短下腔静脉，使灌流液从下腔静脉流出，或是通过残存在肝组织块中的小血管进行灌流分离肝细胞，使这种方法的应用需要的肝组织块较大。但人肝组织块的获取途径较少，血管保留较完整的肝组织块很难获取，人肝组织块通常是在手术中切除病变的周围正常肝组织而获得，所能获取的肝组织块较小，且形状极不规则，很难找到可供灌流的血管，即便找到，其灌流效果也很不理想。

【发明内容】

本发明为解决上述问题，提供便于对尺寸较小的肝组织块进行灌流的灌流液灌注方法。

为实现该目的，本发明采用如下技术方案：

用于肝细胞分离实验的灌流液灌注方法，其包括：

在肝组织块的表面选出多个穿刺区，每个所述穿刺区内选取至少三个穿刺点用于灌注灌流液；

在所述穿刺点的位置将注射器的注射口刺入所述肝组织块，并匀速灌注前灌流液，直至所述肝组织块由暗红色逐渐变为灰白色且流出的前灌流液变清亮，以去除所述肝组织块的血窦内的血细胞及非实质细胞；

再用注射器在所述穿刺区刺入所述肝组织块，并匀速灌流后灌流液，直至所述肝组织块变疏松、失去弹性，且表面呈龟背状裂隙；

停止灌流，至此灌注完成。

进一步的，所述穿刺区选取在所述肝组织块上带有包膜的包膜区。

可选的，所述穿刺区均匀的分布于所述肝组织块的表面。

具体的，在所述肝组织块的表面选出多个穿刺区之前，还包括：用清洗液清洗待灌流的肝组织块表面的血污。

进一步的，同一所述穿刺区内的多个所述穿刺点以不同的深度刺入所述肝组织块。

可选的，所述前灌流液的灌流速度为20ml/min。

具体的，所述肝组织块放置于恒温环境中，以保持所述前灌流液和所述后灌流液灌流过程中的温度恒定。

优选的，其特征在于，所述清洗液为D-Hank’s液。

可选的，所述前灌流液为预热的无钙平衡盐溶液。

可选的，所述后灌流液为预热的Ⅱ型胶原酶溶液。

与现有技术相比，本发明通过在肝组织块的表面选取多个穿刺区，并灌注灌流液的方式对肝组织块进行灌流，解除了肝组织块的大小和肝组织块内的血管完整度对肝细胞分离实验中灌注灌流液的限制。

在进一步优化的技术方案中，在同一穿刺区内选取至少三个穿刺点，并分别灌注灌流液，使灌流液具有多个灌流起点，从而使灌流液通过不同的毛细血管和细胞间隙路径灌流肝组织块，保证灌流效果。