[发明专利]一种利用番茄斑萎病毒NSm基因进行抗病基因筛选的方法

权利要求书

1.一种利用番茄斑萎病毒NSm基因进行抗病基因筛选的方法，其特征在于，包括如下步骤：

鉴定出番茄斑萎病毒基因组中激发含有抗性位点RTSW的烟草产生抗病反应的无毒基因，该无毒基因是NSm基因，核苷酸序列如SEQ ID No.1 所示；

用所述番茄斑萎病毒基因组中的所述无毒基因构建含有所述无毒基因NSm的植物表达载体，并通过农杆菌注渗法将构建好的含有所述无毒基因NSm的植物表达载体导入根癌农杆菌菌株中，之后制得带有所述无毒基因NSm植物表达载体的农杆菌悬液；

构建含候选抗病基因的植物表达载体，并将候选抗病基因的植物表达载体导入根癌农杆菌菌株中，之后制得带有候选抗病基因植物表达载体的农杆菌悬液；

将带有所述无毒基因NSm植物表达载体的农杆菌悬液和带有候选抗病基因植物表达载体的农杆菌悬液一起注渗到本氏烟叶片脉间，并检测本氏烟叶片的过敏反应；若在本氏烟叶片上检测到所述过敏反应，则表明该候选抗病基因为该无毒基因的抗病基因。

2.根据权利要求1所述的利用番茄斑萎病毒NSm基因进行抗病基因筛选的方法，其特征在于，所述鉴定出番茄斑萎病毒基因组中激发含有抗性位点RTSW的烟草产生抗病反应的无毒基因，具体包括：在所述番茄斑萎病毒基因组中搜索已注释的病毒功能基因，并从病毒的功能基因中验证出特异针对RTSW抗性位点的无毒基因。

3.根据权利要求1或2所述的利用番茄斑萎病毒NSm基因进行抗病基因筛选的方法，其特征在于，用所述番茄斑萎病毒基因组中的所述无毒基因构建含有所述无毒基因NSm的植物表达载体，并通过农杆菌注渗法将构建好的含有所述无毒基因NSm的植物表达载体导入根癌农杆菌菌株中，之后制得带有所述无毒基因NSm植物表达载体的农杆菌悬液，具体包括：

克隆所述无毒基因NSm全长序列，之后将该基因克隆于表达双元载体pK2GW7中，构建含有所述无毒基因NSm的植物表达载体；

通过农杆菌注渗法将含有所述无毒基因NSm的表达载体导入根癌农杆菌EHA105 菌株中，之后将包含无毒基因NSm的农杆菌在根癌农杆菌培养基LB中，于28℃培养24小时，离心收集菌体，再用浸润缓冲液稀释成OD600＝0.5的菌体悬液，制得带有所述无毒基因NSm植物表达载体的农杆菌悬液。

4.根据权利要求1或2所述的利用番茄斑萎病毒NSm基因进行抗病基因筛选的方法，其特征在于，构建含候选抗病基因的植物表达载体，并将候选抗病基因的植物表达载体导入根癌农杆菌菌株中，之后制得带有候选抗病基因植物表达载体的农杆菌悬液，具体包括：

克隆所述候选抗病基因全长序列，之后将其克隆于表达载体pHellsgate8中，构建含有所述候选抗病基因的植物表达载体；

通过农杆菌注渗法将含有所述候选抗病基因的植物表达载体导入根癌农杆菌EHA105菌株中，之后将包含候选抗病基因的农杆菌在根癌农杆菌培养基LB中，于28℃培养24小时，离心收集菌体，再用浸润缓冲液稀释成OD600＝0.5的菌体悬液，制得带有候选抗病基因植物表达载体的农杆菌悬液。

5.根据权利要求1或2所述的利用番茄斑萎病毒NSm基因进行抗病基因筛选的方法，其特征在于，将带有所述无毒基因NSm植物表达载体的农杆菌悬液和带有候选抗病基因植物表达载体的农杆菌悬液一起注渗到本氏烟叶片脉间，具体包括：

将带有所述无毒基因NSm植物表达载体的农杆菌悬液和带有候选抗病基因植物表达载体的农杆菌悬液按照体积比为1：1混合，并控制混合后菌体悬液的OD600＝0.5；

用无菌的去掉针头的注射器，将菌体悬液9.5-10.5微升，从本氏烟的叶背注渗入叶脉间，形成一个可见的浸润斑；将接种后的本氏烟置于20-28℃及80％湿度的环境中，交替进行连续光照16小时及连续黑暗8小时，共观察72小时。

6.根据权利要求5所述的利用番茄斑萎病毒NSm基因进行抗病基因筛选的方法，其特征在于，检测本氏烟叶片的过敏反应，具体包括：

在本氏烟上以含有pK2-35S-NSm+p2300-35S-Sw-5b的EHA105菌株作阳性对照，观察若本氏烟上产生混合后菌体悬液诱导的过敏反应，则表明该候选抗病基因为该无毒基因的抗病基因。