[发明专利]基于磁性分离和量子点标记的副溶血性弧菌检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种基于磁性分离和量子点标记的副溶血性弧菌检测试剂盒，它包括：抗副溶血性弧菌免疫磁珠、量子点标记的抗副溶血性弧菌的纳米荧光生物探针；所述的抗副溶血性弧菌免疫磁珠是羧基化磁珠利用EDC和NHS活化后，再与兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体IgG共价偶联；所述的纳米荧光生物探针是羧基化的荧光量子点活化后，与副溶血性弧菌鸡卵黄抗体IgY偶联；利用本发明制备的试剂盒进行副溶血性弧菌的检测具有特异性强、重复性好、灵敏度高的优点，可用于对食品中副溶血性弧菌的快速检测。

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，具体涉及基于磁性分离和量子点标记的副溶血性弧菌检测试剂盒。

背景技术

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，Vp）是一种嗜盐性弧菌，存在于近海的海水、海底沉积物和鱼类、贝类等海产品或盐腌渍品中，它是我国沿海地区最为常见的一种食源性致病菌。其引起的食物中毒，主要引起急性胃肠炎甚至败血症。近年来由副溶血性弧菌引起食物中毒的发生规模以及人群暴露规模呈明显上升趋势，已经超过沙门氏菌，跃居微生物食源性疾病病原菌第一位，成为我国首要的食源性致病菌。因而，加强对食品中副溶血性弧菌的快速准确的检测技术研究十分必要。

目前对副溶血性弧菌的检测方法，主要有传统分离培养及鉴定法、免疫学方法及基于PCR的分子生物学方法等。分离培养及鉴定法是检测副溶血弧菌的标准检验方法，它包括前增菌、选择性增菌、选择性培养、生化鉴定和血清学反应等过程。该方法检测结果相对可靠，但存在分离细菌操作步骤复杂、检测时间长等缺点，难以满足当今社会对食源性致病菌快速检测的需要。免疫学方法是基于抗原和抗体特异反应的原理而进行的一种检测方法，具有操作简便、快速等优点，但其检测灵敏性及特异性易受抗体吸附能力和抗体特异性以及基质背景干扰等因素的影响，同时存在交叉反应，检测结果准确性受限。以 PCR 为基础的定性、定量分析方法是目前应用较为广泛的分子生物学检测方法，该方法具有特异性强、灵敏度高等特点，虽然可以满足快速检测的要求，但操作过程中易出现交叉污染和错误信号的放大等缺点，造成假阳性或假阴性结果，影响实验结果的准确性。PCR应用要求有严格的实验室分区、实验室管理和质量控制措施，对设备和操作人员的要求较高，不利于在基层日常的检测工作中普及和应用。此外，由于食品中副溶血性弧菌的检测，通常需要较复杂的样本处理及长时间的预增菌过程，尤其在病原菌含量较低情况下难于检出。因此，采用一种有效的样品前富集技术，建立一种快速、简便、灵敏度高、特异性强的副溶血性弧菌检测方法，对加强食源性疾病的预防和控制具有重要意义。

近年来，一些新的病原体检测技术迅速发展起来，并逐渐应用于卫生检验工作中。免疫磁珠分离 (Immunomagnetic Separation，IMS) 技术是将免疫学反应与微球的磁性相结合的一种免疫学技术，它可将富集、分离融为一体，在免疫学检测、细胞分离、蛋白质纯化等方面有广泛应用，具有操作简便、快速、高效等优点。在食源性致病菌的检测方面，IMS法有效结合抗原-抗体反应的特异性和磁珠的磁场响应性，可实现从复杂基质中对目标菌的快速分离和富集，能够有效消除基质干扰，从而提高检测效率，是有效的样品前处理方法，具有较好的开发应用前景。鸡卵黄抗体（IgY）是通过免疫注射产蛋鸡，从鸡蛋中分离出的抗体，制备技术方法简单，制备的抗体产量高且性质稳定，可以弥补单克隆抗体制备繁琐、抗体产量低等缺点，在微生物检测和疾病治疗等方面已广泛应用。因此，在获得理想效价及高特异性的IgY抗体的基础上，将其应用于免疫学方法检测食品中的VP，可有效缩短检测时间、提高方法准确性。量子点( quantum dots，QDs) 是一种新型的半导体纳米材料，具有较好的光化学特性和光谱特性，作为一种新型的标记材料，与传统的荧光染料相比，具有荧光寿命长，激发光谱宽，发射光谱窄，对称性好，易于合成和生物修饰等特点，使量子点作为荧光探针在分析化学、卫生检测等领域得到了广泛的应用。本研究拟联合利用免疫磁珠分离技术、鸡卵黄抗体技术和量子点荧光标记技术，依据抗原抗体特异性反应的原理，通过免疫磁珠上的抗体与样品中目标菌的特异性结合，从样品中富集分离出目标菌，再利用制备的量子点纳米荧光生物探针进行标记，得到磁珠-细菌抗原-量子点“三明治”复合物，通过对复合物的量子点荧光强度进行检测，从而实现对目标菌的快速、定量的检测。