[发明专利]Blec蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了Blec蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用。本发明以原核表达的Blec蛋白为免疫原免疫鼠，将免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞融合，经过多次筛选和亚克隆，获得特异性的单克隆细胞株blec‑3D3以及由其分泌的单抗blec‑3D3。利用单抗blec‑3D3对鸡外周血淋巴细胞进行流式细胞术检测，结果表明blec蛋白主要表达于CD3+和CD4+细胞；免疫组化检测结果表明，单抗blec‑3D3能在鸡黏膜免疫相关组织检测到特异性信号。本发明提供的blec单抗可作为检测抗体检测动物组织或细胞内的Blec蛋白的分布、表达或生物学功能。

技术领域

本发明涉及鸡C-型凝集素样受体蛋白Blec单克隆抗体以及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，本发明进一步涉及它们在检测blec蛋白的组织学分布、体内和体外表达中的应用，属于鸡凝集素样受体蛋白Blec单克隆抗体的制备和应用领域。

背景技术

鸡blec基因位于主要组织相容性复合体(Major histocompability complex,MHC)的核心区域，在不同单倍型之间保守性较强。根据编码蛋白的推导氨基酸序列分析，为C-型凝集素样结构，可能与鸡的自然杀伤细胞非MHC I类分子介导的细胞杀伤功能有关。但至今blec蛋白的结构、在鸡体内的组织学分布尚未见明确报道。

利用Blec蛋白特异性单克隆抗体，可通过免疫组织化学技术分析鸡体内blec蛋白的组织学分布，这对于研究blec蛋白的结构、生物学功能以及在鸡体内的组织学分布具有重要的价值。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一株稳定分泌Blec蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

本发明所要解决的第二个技术问题是将该杂交瘤细胞株分泌的Blec蛋白单克隆抗体应用于检测鸡体内的Blec蛋白的表达或分布。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明为获得MHC单倍型鸡保守的blec蛋白特异性单抗，并适合于blec蛋白功能研究，本发明根据网上公布的所有不同单倍型鸡Blec基因序列，比对推导氨基酸序列结果，发现存在5个变异位点，为了获得适用于表面配体功能分析的单抗，本发明最终确定选择Ala59-Leu176区域进行表达。选择最保守的B21单倍型鸡为实验材料，参考标准序列设计引物，扩增blec胞外区(Ala59-Leu176)基因，构建pET-Blec21重组质粒，以保证获得型通用型单抗。IPTG诱导pET-blec21原核表达重组菌，超声波破碎，用盐酸胍处理，获得包涵体；在复性液中复性，浓缩，凝胶过滤层析柱中纯化蛋白，获得纯化的Blec蛋白。

取7周龄无特定病原体BALB/c雌性小鼠，用纯化的blec蛋白进行免疫，50μg/小鼠，腹腔注射。每隔2周免疫一次，第3次免疫后一周采集免疫鼠血，37℃放置1h，4℃离心10min分离血清。将血清倍比稀释，用间接ELISA检测血清效价，选择血清效价最高的小鼠于融合前3天加强免疫。将免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞融合，经过3次筛选和3次亚克隆，获得特异性强、稳定性好的单克隆细胞株blec-3D3。

本发明对单克隆细胞株blec-3D3进行亚类鉴定，鉴定结果显示，blec-3D3的重链是IgM，轻链为Kappa链。

Western blot鉴定结果表明，blec-3D3能特异性检测到鸡体内黏膜免疫相关组织中的Blec蛋白。

本发明将分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株blec-3D3提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.12998；分类命名为：BALB/c小鼠杂交瘤细胞。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2016年10月26日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

流式细胞术检测结果表明，应用本发明的Blec单抗可用于检测鸡外周血中表面表达blec蛋白的细胞种类。