[发明专利]一种基于靶蛋白亲和整体色谱柱分离细菌生物膜抑制成分的方法

说明书

一种细菌生物膜抑制成分的分离鉴定方法，其包括：(1)色谱柱的原位聚合；(2)受体蛋白的原位固定化；(3)受体蛋白亲和整体色谱柱的性能评价；(4)将含有细菌生物膜抑制活性的样品过亲和整体色谱柱；(5)亲和纯化洗脱液中细菌生物膜抑制活性的检测；其中所述受体蛋白为群感系统中与生物膜相关的受体蛋白。所述方法通过检测QSI活性鉴定生物膜抑制成分，不仅操作简单、方向明确，而且能有效减少假阳性产物；对天然药物中抗菌活性成分的分离鉴定有重要意义。

技术领域

本发明属于天然药物分离领域，具体涉及一种基于靶蛋白亲和整体 色谱柱的细菌生物膜抑制成分的分离鉴定方法、以及所述分离鉴定方法 中使用的分离装置。

背景技术

近年研究发现，细菌附着后分泌粘性胞外基质并在其中生长繁殖而形 成的具有高度构造性的复合物，即细菌生物膜(bacterial biofilm，BBF)，是 导致耐药行为的重要原因。现有抗生素应用不仅不能有效清除BBF，还会 诱导产生耐药性，因而引起了广泛的关注。

深入研究发现，BBF的形成等一系列病原菌的生命活动均依赖于群体 感应(quorum sensing，QS)系统的调控。群体感应抑制剂(QS inhibitor， QSI)有别于传统抗菌药的作用机制，一方面通过抑制该系统相关受体蛋白 来调控其致病行为(包括BBF形成、外毒素和各种侵袭性酶类的合成和 分泌等)，另一方面并不杀灭细菌从而避免了选择性压力导致的耐药，这为 从根本上解决细菌的抗药性问题提供了全新的研究思路。

我国中药和天然药物资源极其丰富，药用植物近万种，为抗菌药物发 现提供了重要的物质来源基础。目前已在植物中分离鉴定了一些有效的 QSI，例如从伞形科植物中发现的法卡林二醇，从补骨脂中分离的补骨脂 素，从佛手中发现的佛手苷内酯等。药用植物源的QSI相此于化学合成抗 菌药物，具有低毒、廉价、不良反应及副作用相对较小、不易产生耐药性 等优势。从天然药物中发掘靶向群感效应的抗菌药效物质，不仅具有切实 的可行性，而且有利于经典中药焕发出新的生命力。

然而，现有从中药中获取QSI的策略和方法都同时存在着严重的瓶 颈。从筛选策略上看，基于中药成分复杂多样的特点，从中获取QSI一般 必需先经过提取分离鉴别得到单体化合物，然后对每一个单体进行药效学 筛选验证。显然，这种“先分离鉴别，后筛选验证”的策略不仅耗时，效率 低，而且费用高昂。同时，由于中药里QSI含量较少，分离纯化困难，导 致大部分仅能停留在粗提物上来考察抑制活性。因此，寻找更多高效的 QSI，有效实现对BBF的抑制作用，成为了目前亟待解决的重要科学问题。

现有技术中最新的QSI筛选方法主要集中于以下三类：(1)天然的活 性指示菌分析筛选法，基于QS系统能够调控细菌某些色素基因的表达， 直观快速地筛选出QSI，虽然适合大量样品的粗筛，方法也简便易行，但 由于样品有可能对菌体的生长有一定的抑制作用，因而不能排除干扰因素 而导致的假阳性结果。(2)QSI选择器(QSI Selector，QSIS)筛选法，通过 自杀基因sacB模型进行定性初筛，再利用luxCDABE，lacZ，gfp等模型进 一步量化，从而避免了假阳性结果的出现，已经成功获得了许多具QSI活 性的合成化合物和天然提取物，但操作复杂，筛选成本高且不适合微量分 析，例如CN105504002A。(3)计算机虚拟筛选法，筛选速度快、成本较 低，有助于提高开发新型药物的效率；但准确性需要进一步考察，仅适用 于初筛阶段。

鉴于现有筛选策略和技术的局限性，严重阻碍了中药QSI的阐明。因 此，寻找其他高效、准确、简便的筛选方法意义重大。

发明内容

针对上述现有技术中的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种 方法简单、方向明确、能适应高通量筛选的细菌生物膜抑制成分分离鉴 定方法。

具体而言，本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：

一方面，本发明提供一种细菌生物膜抑制成分的分离鉴定方法，其特 征在于包括以下步骤：