[发明专利]一种气动注射器的细胞抽核方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞级别的显微操作技术领域。

背景技术

细胞的抽核过程是核移植、克隆等生物操作的关键步骤。通过学习，我们了解到当前的细胞抽核方法主要为液动注射器的细胞抽核方法，该抽核方法主要将注意力集中在了抽核成功率上，因液动注射器抽核方法无法对抽核过程中的压强实时反馈，难以判定抽核过程对于细胞的损伤，因而对于抽核操作本身对于细胞损伤的研究较少。但抽核操作本身对于细胞的损伤会对后续的细胞核移植、克隆等操作又会造成较大影响，因此设计一个能减小细胞损伤的细胞抽核方法十分必要。

发明内容

本发明目的是解决抽核操作本身对于细胞所造成的损伤问题，提供一种气动注射器的细胞抽核方法，以便减小细胞抽核所受的伤害，提高细胞抽核操作后的细胞发育潜力以及后期的克隆、核移植操作的成功率。

本发明提供了一种气动注射器的细胞抽核方法，所述方法特别在抽核用的微针前端吸取一些操作液，进而实现了在抽核过程中减小了对细胞所造成的损伤。

所述方法具体包括以下步骤：

第1、通过气动注射器对微针施加正压。

具体操作：在已经将待抽核的细胞准备好并固定住后，通过气动注射器对抽核用的微针施加正压，根据平衡压模型：

P_i＝P_out+2σcosα/R

其中，P_i表示平衡压，P_out表示外界气压，σ表示卵母细胞操作液的表面张力系数，α表示液面与内壁的接触角，R表示气液交界面处的微管内壁半径。

通过气动注射器对微针施加的正压不能超过外界气压与针口位置毛细作用产生的压强的和，否则微针内部的气体会喷射出来；

第2、将抽核用的微针浸入操作液，减小微针中的正压，通过毛细作用吸取卵母细胞操作液到微针前端。

具体操作：将抽核用的微针浸入操作液，并移动至显微视野当中，减小微针中给定的正压，通过毛细作用吸取卵母细胞操作液到微针的前端，准备进行抽核；

第3、将微针刺入细胞中以进行后续的抽核操作。

具体操作：移动微针以及细胞使抽核用的微针以及细胞在一个显微视野范围内，将抽核用的微针刺入细胞内细胞核位置附近准备后续的抽核操作。

第4、减小微针中的正压，通过毛细作用实现细胞的抽核行为，进而实现了此种减小细胞损伤的抽核过程。

此时微针会通过毛细作用实现胞质以及细胞核的抽取。并且因为微针管内有一段液体，可以实现抽核过程中对细胞损伤的减小。

本发明的优点和积极效果：

本发明实现了一种气动注射器的细胞抽核方法。该方法较以往的细胞抽核方法，抽核成功率基本不变，其中，未吸取卵母细胞操作液到微针内部进行抽核操作的实验进行了4次，囊胚情况分别为：操作10个细胞获得1个囊胚，操作10个细胞获得1个囊胚，操作20个细胞获得2个囊胚以及操作20个细胞获得2个囊胚，囊胚率为10％，而吸取了卵母细胞操作液后进行抽核操作的实验得到的囊胚情况为：操作17个细胞获得4个囊胚，操作22个细胞获得4个囊胚以及操作14个细胞获得3个囊胚，囊胚率为21％。较以往抽核方法提高了2倍。实现了减小细胞损伤的抽核方法，为后续提高克隆成功率打下了基础。

附图说明

图1实验流程框架图。

图2为抽核方法的抽核流程图(左：原理图；右：实验图)。

图3为细胞电融合示意图。

图4为未吸取操作液和吸取操作液进行抽核的对照图(左：未吸取操作液；右：吸取

操作液)。

具体实施方式

实施例1

本实施例为克隆操作的抽核过程，其中所使用的卵母细胞是从当地屠宰场所取的家猪卵母细胞，使用的核供体细胞为“加系”大白猪胎儿细胞。

卵母细胞的获取方法如下：

卵巢从屠宰场取出后，在两个小时之内用装有35°到37°的生理盐水的保温瓶运送到实验室。然后立刻用37°的含有100IU/L的盘尼西林和50mg/L的链霉素的无菌生理盐水清洗两次。卵母细胞从卵巢上的2到6毫米直径的小囊中抽取，将抽出的细胞用TL-Hepes-PVA冲洗三次后在39°、二氧化碳浓度5％的培养箱内体外成熟培养(IVM)42小时。经过IVM后，将细胞用0.1％的透明质酸酶进行脱卵。最后用M199将细胞清洗三次，得到的这些细胞为本例中所用卵母细胞。