[发明专利]一种脐带间充质干细胞冻存液及其使用方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学、生物医学技术领域，具体涉及一种脐带间充质干细胞冻存液及其使用方法。

背景技术

脐带是连于胚胎脐部与胎盘间的索状结构，外覆羊膜，内含静脉，脐动脉和来自中胚层的胶样粘液性结缔组织即沃顿氏胶。大量研究证实脐带沃顿氏胶中富含丰富的间充质干细胞。

脐带间充质干细胞(MSCs)具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。它在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景；具有较强的免疫调节作用，可用于治疗红斑狼疮和硬皮病等自身免疫性疾病，降低细胞或器官移植后的免疫排斥反应，提高细胞或器官移植的成功率；能促进造血恢复功能，与单一造血干细胞移植比较，间充质干细胞和造血干细胞共移植能显著提高白血病和难治性贫血等疾病的治疗效果；能修复损伤或病变的组织器官，用于治疗骨和肌肉衰退性疾病、心脑血管疾病、肝病、脑及脊髓神经损伤和老年痴呆等。

细胞冻存在不加保护条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水会形成冰晶，能导致细胞内发生一系列的变化，如机械损伤、电解质浓度升高、渗透压改变、脱水、pH值改变、蛋白质变性等，能引起细胞死亡。但如向培养基中加入保护剂(甘油或DMSO)，可使冰点降低，在缓慢的冻存条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外。储存在-130度以下低温中能加水冰晶的形成。溶解细胞时，速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的-5～0摄氏度后，细胞仍能生长，活力不受任何损害。当前使用的保护剂为DMSO和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞，使用浓度范围在5～10％之间，常用10％。

为保护细胞最大存活率，通常用细胞培养基作为溶剂，除二甲基亚砜外，还添加各种细胞保护及营养物质，以提高细胞活率；为获得来源方便的脐带间充质干细胞，提高细胞活率，开展有效的干细胞移植及建立干细胞库，改进干细胞冻存复苏技术，为建立一种长期低温保存干细胞的方法的研究和应用具有重大意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种脐带间充质干细胞冻存液及其使用方法，使用本发明提供的细胞冻存液长时间冻存后的细胞复苏活率较高。

一种脐带间充质干细胞冻存液，是在DMEM/F-12培养基中含有

所述的脐带间充质干细胞冻存液，优选地是在DMEM/F-12培养基中含有

所述的脐带间充质干细胞冻存液的使用方法，是取培养12-15d生长良好的细胞瓶，将培养液倒入离心管中，做为终止液，然后用胰酶消化5min使细胞悬浮，再加入终止液终止消化，离心后弃去上清，再加入生理盐水洗涤后，再次离心，得到所述的脐带间充质干细胞冻存液冻存获得的细胞，按冻存细胞数所需浓度为2×10⁷个细胞/ml冻存液，定量加入预冷的所述的神经干细胞冻存液，充分混匀后，将此细胞悬液转移至冻存管中，每管1ml，封口，标记冻存日期，放于程序降温盒中；分级冷冻细胞：4℃，40min；-20℃，30min；-80℃，过夜；次日缓降至液氮表面直至投入液氮保存。

上述的脐带间充质干细胞冻存液的使用方法，是使用的胰酶浓度为0.125％含EDTA的胰酶37℃消化5min。

本发明采用Ultroser^TMG血清替代物代替胎牛血清作为细胞的营养来源，Ultroser^TMG包含6类真核生物细胞生长所必须的营养物质，包括粘附因子，结合蛋白，生长因子，微量矿物元素，荷尔蒙，维生素等；与胎牛血清相比，它的生物活性是胎牛血清的5倍，营养成分更为丰富，提高间充质干细胞冻存复苏率，使用浓度低，节约了成本；而右旋糖酐-40可以很好的维持渗透压，在温度下降过程中，仍能维持良好的渗透压环境，避免了细胞因温度下降，渗透压改变而出现细胞死亡的现象，从而提高了间充质干细胞冻存复苏率。

附图说明

图1为使用不同脐带间充质干细胞冻存液冻存的细胞复苏后细胞的生长状态。

图2为使用本发明脐带间充质干细胞冻存液冻存的细胞复苏后的流式细胞检测结果。

具体实施方式

以下结合具体实施方式旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

1)脐带间充质干细胞冻存液的配制：

10ml间充质干细胞冻存液中含有以下组分：

碱性成纤维细胞生长因子bFGF(母液浓度为50ug/ml)10ul(终浓度50ng/ml)，