[发明专利]一种具有高转糖苷活性的β-半乳糖苷酶组合突变体及其制备方法和应用

说明书

本发明属于基因工程和遗传工程领域，公开了一种具有高转糖苷活性的β‑半乳糖苷酶组合突变体，其是在去除了自身信号肽的亮白曲霉和米曲霉的β‑半乳糖苷酶的氨基酸序列的基础上，通过双位点的定点饱和突变所获得的，在低聚糖生成量保持不变的情况下，该突变体的转糖苷反应速率比野生型提高100％以上。同时，本发明还公开了编码上述组合突变体的DNA分子、含有上述DNA分子的重组表达载体以及表达上述DNA分子的宿主细胞。此外，本发明还提供了采用上述重组表达载体制备具有高转糖苷活性的β‑半乳糖苷酶的方法以及上述组合突变体、DNA分子、重组表达载体和宿主细胞在制备β‑半乳糖苷酶中的应用。

本申请是申请号为201410514519.1，申请日为2014年9月29日，名称为“一种具有高转糖苷活性的β-半乳糖苷酶组合突变体及其制备方法和应用”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及基因工程和遗传工程领域，具体涉及一种具有高转糖苷活性的β-半乳糖苷酶组合突变体及其制备方法和应用。

背景技术

低聚半乳糖(GOS)是一类在人体胃肠道内不能被消化吸收而直接进入大肠被各种双歧杆菌良好利用的具有特殊生物学功能的低聚糖。它能够改善人体内微生态环境，有利于双歧杆菌和其它有益菌的增殖，提高人体免疫功能。同时，GOS经代谢产生有机酸使肠内pH值降低，抑制肠内沙门氏菌和腐败菌的生长，减少有毒发酵产物及有害细菌酶的产生，调节胃肠功能，减轻了肝脏分解毒素的负担。由于低聚半乳糖有着比其他功能性低聚糖更优良的性质，从而使低聚半乳糖作为添加剂大规模应用更方便易行，能够适应更多的食品种类和更广的消费群体，有巨大的应用价值和市场潜力。

GOS制备方法通常有五种：从天然原料中提取、天然多糖的酸水解、化学法合成、发酵法及酶法合成。由于GOS在自然界中含量低，无色不带电荷故难以提取分离；天然多糖转化产品得率低，产物成分复杂，难以纯化；化学法毒性大易残留，对环境污染重；发酵法生产GOS的研究很少，仍处于实验室规模，无法进行大量生产。目前低聚半乳糖的工业化生产是通过β-半乳糖苷酶完成的。β-半乳糖苷酶(β-D-galactoside galatohydrolase，EC3.2.1.23)又称乳糖酶(Lactase)，具有水解和转糖苷的双重作用。早先对于β-半乳糖苷酶的研究主要集中在利用其水解功能生产低乳糖乳制品，来解除乳糖不耐受患者因食用乳制品而引起的腹泻、腹胀等多种不良反应。随着低聚半乳糖特殊的保健功能的确定，利用β-半乳糖苷酶的转糖苷作用生产低聚半乳糖成为研究热点。主要集中在以下三个方面：

1、筛选高转糖苷活性的β-半乳糖苷酶产生菌

酵母、芽孢杆菌、曲霉、青霉、双歧杆菌等多种微生物中都有具转糖苷酶活性的β-半乳糖苷酶。研究表明，不同来源的β-半乳糖苷酶因其酶学性质各异，合成低聚半乳糖时的反应条件大不相同。β-半乳糖苷酶根据最适pH可分为酸性和中性两种。通常霉菌来源的β-半乳糖苷酶为酸性酶，其作用最适pH在pH2.5～5.5，最适反应温度较高(50～60℃)；酵母和细菌所产的β-半乳糖苷酶为中性酶，其最适pH介于pH 6～7.5，最适反应温度较低(30～40℃)。不同来源的β-半乳糖苷酶作用的底物类型也不尽相同，由此生成的低聚半乳糖中寡糖的种类和比例也千差万别，这就使低聚半乳糖家族的新成员层出不穷。尽管如此，筛选到的天然β-半乳糖苷酶的转糖苷活性普遍较低，低聚半乳糖的最高产率通常只有5～30％，无法满足工业化生产的要求。

2、优化反应条件、改进生产工艺