[发明专利]一种用于测定生物基质中硒代蛋氨酸的方法

说明书

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种用于测定生物基质中硒代蛋氨酸的方法。本发明提供的用于测定生物基质中硒代蛋氨酸的方法，其包括下述步骤：(1)样品预处理：取生物基质样品，加入内标物甲基硒代半胱氨酸，然后用蛋白质沉淀法处理所述生物基质样品，离心得到上清液；(2)含量测定：采用高效液相色谱串联质谱技术(LC‑MS/MS)色谱法，将步骤(1)中上清液注入色谱仪，计算生物基质样品中硒代蛋氨酸的浓度。本发明的生物基质采用蛋白质沉淀法，硒代蛋氨酸提取效率高，且生物基质对测定硒代蛋氨酸无干扰，采用LC‑MS/MS色谱法测定生物基质中的硒代蛋氨酸，速度快、专属性好、准确度高，重现性好。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种用于测定生物基质中硒代蛋氨酸的方法。

背景技术

硒是人和动物必需的微量元素，硒仅以硒代蛋氨酸(SeMet)和硒代半胱氨酸两种形式存在于硒蛋白中，且大部分硒为SeMet。硒通过硒蛋白影响机体内的自由基代谢、抗氧化功能、免疫功能、生殖功能、细胞调亡和内分泌激素等而发挥其生物学作用，克山病、大骨节病、糖尿病、艾滋病等40 多种疾病与缺硒有关。因此，生物体内SeMet含量是反应体内活性硒水平的重要生理指标。

全世界有40多个国家和地区不同程度的缺硒，我国2/3的地区属于缺硒地区，29.0％的地区严重缺硒。提高我国居民的日常硒摄入量，对于改善国民健康有重大意义。硒形态是影响硒的生物利用度和毒性的重要因素。无机硒的吸收效果和安全性远远不及有机硒。有机硒的基本存在形式为硒蛋白，硒仅以SeMet和硒代半胱氨酸两种形式共价结合在蛋白质中，SeMet是生物利用度最高的有机硒化物。因此，测定动物源性食物中SeMet水平对保证膳食摄入硒量和最佳硒有重要意义。

生物体内SeMet水平较低，因此需采用更为灵敏分析方法测定。目前，测定SeMet的主要分析方法为高效液相色谱电感耦合等离子体质谱法 (HPLC-ICP-MS)、气相色谱质谱联用法(GC-MS)、毛细管电泳法(CE)。但是HPLC-ICP-MS法只能对Se元素进行定量测定，不能测定SeMet原形态，尤其是在机体内存在多种硒形态时，需要SeMet标准品测定，并且一旦有其他硒化合物与SeMet在色谱上有相同的保留时间时，则根本无法鉴定SeMet； GC-MS对于SeMet等非挥发性硒化物的检测需要进行衍生物化处理，存在较多困难；毛细管电泳法在与ICP-MS联用时，所需流速不同，限制其发展应用。

本发明所述的硒代蛋氨酸的化学式为C₁₅H₁₁NO₂Se，分子量为196.1063，结构式为：

发明内容

本发明所解决的现有技术问题是：现有技术中采用高效液相色谱电感耦合等离子体质谱法(HPLC-ICP-MS)、气相色谱质谱联用法(GC-MS)、毛细管电泳法(CE)，但是用高效液相色谱电感耦合等离子体质谱法 (HPLC-ICP-MS)进行测定时，只能对Se元素进行定量限定，不能测定SeMet 原形态，尤其是在机体内存在多种硒形态时，需要SeMet标准品测定，并且一旦有其他硒化合物与SeMet在色谱上有相同的保留时间时，则根本无法鉴定SeMet；GC-MS对于SeMet等非挥发性硒化物的检测需要进行衍生物化处理，存在较多困难；毛细管电泳法在与ICP-MS联用时，所需流速不同，限制其发展应用。

本发明通过在生物基质样品中加入内标物，然后使用蛋白质沉淀法对生物基质样品进行处理，然后离心得到上清液，将上清液注入高效液相色谱串联质谱色谱法(LC-MS/MS)，采用内标标准曲线法计算生物基质样品中SeMet 的浓度。

具体来说，本发明提出了如下技术方案。

一种用于测定生物基质中硒代蛋氨酸的方法，其特征在于，其包括下述步骤：

(1)样品预处理：取生物基质样品，加入内标物甲基硒代半胱氨酸，然后用蛋白质沉淀法处理所述生物基质样品，离心得到上清液；