[发明专利]一种罗氏沼虾微胞子虫可视化快速检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于靶基因片断的快速检测领域，具体地说，涉及一种罗氏沼虾微胞子虫可视化快速检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

罗氏沼虾微胞子虫(Macrobrachium rosenbergii Microsporidium，MrMSP)是一种严重影响罗氏沼虾幼体、成虾肠道营养吸收的致病性寄生虫。其可寄生于虾的肠道和肝脏组织，可引起肠道上皮组织损伤，进而造成罗氏沼虾营养吸收不良，影响虾体健康和生长。该病原可间接导致罗氏沼虾因营养吸收受损而个体偏小，养殖产量低。罗氏沼虾微胞子虫是新近发现并在罗氏沼虾苗种中流行的新病原，该病原已在我国罗氏沼虾育苗企业大面积蔓延，根据流行病学调查，2017年罗氏沼虾微胞子虫携带率接近50％。而现阶段又缺乏针对罗氏沼虾微胞子虫的高灵敏检测试剂盒，这已不能满足该病原引起疾病的检疫和预防工作。因此该罗氏沼虾微胞子虫检测试剂盒的开发和检测技术的应用具有潜在巨大的经济效益和社会效益。

发明内容

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种罗氏沼虾微胞子虫可视化快速检测试剂盒，本发明的试剂盒特异性强，敏感性高；本发明罗氏沼虾微胞子虫快速检测方法利用所述试剂盒检测，该方法方便、灵敏、准确、快速。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种用于检测罗氏沼虾微胞子虫扩增用核酸引物组，该引物组包含引物MrMSP-F3、引物MrMSP-B3、引物MrMSP-FIP、引物MrMSP-BIP、引物MrMSP-LpF和引物MrMSP-LpB；

所述的引物MrMSP-F3的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述的引物MrMSP-B3的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述的引物MrMSP-FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

所述的引物MrMSP-BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；

所述的引物MrMSP-LpF的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；

所述的引物MrMSP-LpB的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

本发明还公开了一种罗氏沼虾微胞子虫可视化快速检测试剂盒，包括微胞子虫DNA提取试剂和反应试剂，所述的反应试剂中含有上述的用于检测罗氏沼虾微胞子虫扩增用核酸引物组。

进一步地，反应试剂具体包括以下组分：

a)预反应液：20mM pH为8.8的Tris-HC1、8mM硫酸镁、15mM氯化钾、10mM硫酸按、0.l2％Tween-20、1.4mM dNTP、0.4M甜菜碱、0.2μM引物MrMSP-F3、0.2μM引物MrMSP-B3、1.6μM引物MrMSP-FIP、1.6μM引物MrMSP-BIP、0.8μM引物MrMSP-LpF和0.8μM引物MrMSP-LpB；

b)反应酶：每微升含8个活性单位的Bst 2.0DNA聚合酶；

c)反应封闭液：由矿物油或液体石蜡油组成；

d)反应显色液：含有10％SYBR Green I的荧光染料。

进一步地，微胞子虫DNA提取试剂：成分为60mM Tris、800mM NaCl、0.5％SDS、1％NP-40的pH 8.0的裂解液。

本发明还公开了一种利用上述的罗氏沼虾微胞子虫的快速检测试剂盒进行检测的方法，包括以下步骤：

1)DNA抽提：取罗氏沼虾幼体或苗或鳃丝或肝脏组织30-80mg于2mL离心管中，采用权利要求4所述的微胞子虫DNA提取试剂进行DNA提取；

2)对罗氏沼虾微胞子虫基因进行扩增；

3)对步骤2)中得到的扩增产物进行显色检测。

进一步地，步骤1)中的DNA抽提具体为：向含有组织的2mL离心管加入权利要求4所述的微胞子虫DNA提取试剂200μL，研磨均匀后，95℃以上加热10分钟左右，10000rpm离心10分钟后，上清即为提取的待检DNA模板。

进一步地，步骤2)中的对罗氏沼虾微胞子虫基因进行扩增具体为：

2.1)根据待检测样品的数目，设置所需反应管数N，N＝样品数+2，其中l管为阳性对照，l管为阴性对照；

2.2)吸取所述的预反应液的体积为N×22μL，加入一洁净的1.5mL离心管中，然后加入NμL反应酶，混合均匀，1500～2000转/分钟离心10秒，取上清之混合液；