[发明专利]新型抗菌肽DLP4的制备方法

权利要求书

1.新型抗菌肽DLP4的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)基因表达框的设计：对抗菌肽DLP4的编码基因进行酵母偏爱密码子优化，在优化后的基因序列的5’端添加XhoI酶切位点和Kex2切割位点，在3’端添加TAA和TAG终止子序列以及XbaI酶切位点，所得基因表达框的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示；

2)重组酵母表达载体的构建：将SEQ ID No:3所示的基因经XhoI和XbaI双酶切后，与经过同样双酶切的pPICZαA载体连接，得到的重组酵母表达载体pPICDLP4；

3)重组酵母菌的制备：载体pPICDLP4经线性化后转化感受态毕赤酵母X-33，筛选出高水平表达抗菌肽DLP4的重组酵母菌；

4)抗菌肽DLP4的制备：对步骤3)中获得的重组酵母菌进行发酵培养，通过补加葡萄糖和甲醇诱导，获得发酵液，离心收集上清，上清经纯化后即得抗菌肽DLP4。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)具体为：

①种子液制备：

挑取单菌落接种于YPD培养基中，28～30℃，250rpm振荡培养18～24h；然后按1％的接种量，转接至YPD培养基中，28～30℃，250rpm振荡培养16～18h，OD₆₀₀达到4～6；然后，按10％接种量接到上罐培养基中，即200ml菌液+200ml 45％葡萄糖+9.6ml PMT1，装液量为2L/5L，于29℃，800rpm，pH 5.0，pO₂>35％的条件下培养16-18h；

②添加葡萄糖生长阶段：

观测发酵液的溶氧值开始缓慢下降后突然上升，开始补加含12‰PMT1的50％葡萄糖溶液，添加时间6-8h，流速为30ml/L/h；

③甲醇过渡诱导：

添加葡萄糖6h后，饥饿1h，待葡萄糖耗尽后，开始补加含12‰PMT1的无水甲醇，补加过程中，流速由第1小时1ml/L/h逐渐增加到第6小时6ml/L/h，直至发酵结束；

④100％甲醇诱导阶段：

甲醇过渡诱导6h后，开始100％甲醇连续诱导，流速为6ml/L/h；甲醇诱导开始后，每12h取样，测定重组酵母菌分泌表达抗菌肽DLP4的水平。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中采用阳离子交换层析对上清进行纯化。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，阳离子交换层析纯化的具体操作如下：

发酵液于4℃，12000rpm离心10min后取上清，将长度16mm、内径10mm的HiPrep SP FF阳离子交换柱用A液平衡5-10个柱体积后上样；进样完毕后，先用A液进行洗脱，待穿透峰洗脱完后，用B液进行洗脱，收集洗脱峰；

洗脱步骤为：100％A液，洗脱5个柱体积，为穿透峰；40％A，60％B液，洗脱5个柱体积，为洗脱峰；利用UV215nm监测洗脱情况，Tricine-SDS-PAGE和检测目标产物纯化情况；其中，所述A液为20mM，pH7.0的磷酸盐洗脱缓冲液，所述B液为含有1M NaCl的20mM，pH7.0的磷酸盐洗脱缓冲液；

收集到的洗脱峰，经1KDa截留分子量透析袋4℃透析，每2h换水一次，换水6次；收集透析后的透析液，于-54℃，0.016MPa条件下进行真空冷冻干燥，通过Tricine-SDS PAGE凝胶电泳检测纯化后的抗菌肽DLP4。

5.一种分泌表达抗菌肽DLP4的重组酵母菌，其构建方法包括以下步骤：

1)对抗菌肽DLP4的编码基因进行酵母偏爱密码子优化，在优化后的基因序列的5’端添加XhoI酶切位点和Kex2切割位点，在3’端添加TAA和TAG终止子序列以及XbaI酶切位点，所得基因表达框的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示；

2)将SEQ ID No:3所示的基因经XhoI和XbaI双酶切后，与经过同样双酶切的pPICZαA载体连接，得到的重组酵母表达载体pPICDLP4；

3)载体pPICDLP4经线性化后转化感受态毕赤酵母X-33，即得分泌表达抗菌肽DLP4的重组酵母菌。