[发明专利]一种数字PCR微滴制备方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种数字PCR微滴制备装置及制备方法，属于数字PCR技术领域。

背景技术:

PCR技术是现代生物学最重要的工具之一，它广泛应用在医学诊断、个体化医疗、食品检验、转基因生物检测、病原体鉴定、免疫分析、法医科学等方面。而作为PCR技术的最新一代，基于微流控技术发展产生的数字PCR，具有比传统qPCR更小的反应体积、更快的反应速度、更低的系统噪声和更高的灵敏度。

通过油包水结构，将单个DNA分子封装到单独的微滴中，利用油的惰性实现DNA分子间的相互隔离，每个DNA分子被限制在自己的微滴中单独的进行扩增，避免来自其他序列竞争。在合适的温度条件下完成DNA分子的扩增后，通过记录微滴的总体个数和可以检测到荧光信号的微滴个数，利用泊松分布算法就可以实现对DNA拷贝数的精确定量。

作为数字PCR技术的核心，微滴的制备一直是限制其发展的重要因素。由于数字PCR是通过泊松分布计算事件概率得到最终结果，为了保证结果的准确性，微滴的制备应该满足两个基本条件：1.高数据群体的体量2.优秀的单分散性。正是由于这两个条件的制约，严重限制了数字PCR技术的发展。近几年来，随着纳米制造技术和微流体技术的发展，数字PCR技术遇到了突破技术瓶颈的最佳契机。

本发明涉及一种数字PCR的微滴制备装置及制备方法，满足微滴制备微滴产率高、体积小、单分散性高的系统要求。虽然单分子PCR微流控液滴的利用仍处于早期阶段，但其巨大的应用前景已经被证实，也将为生物医学工程在单分子放大分析等领域面临的挑战提供全新的解决方案。

发明内容：

为了解决数字PCR微滴生成过程中产率低、体积大、单分散性差等关键技术难题，使微滴生成更加简便，本发明提供了一种数字PCR微滴制备方法。

本发明是通过以下技术来实现的：

一种适用于数字PCR微滴生成的微流控装置，其特征在于，包括油相微通道(7)、水相微通道(3)、出口通道(5)、油相入口(1)、水相入口(2)、扩张角(8)；油相微通道(7)整体为长方形环状结构的微通道，长方形环状结构的一边A边的中间位置与水相入口(2)连通，与长方形环状结构的一边A边相对的一边B边的中间位置与水相微通道(3)直接连接连通，同时出口通道(5)在长方形环状结构的B边中间位置也与油相微通道(7)连通；油相微通道(7)通过扩张角与出口通道(5)连接连通，出口通道(5)与出口(6)连通；油相微通道(7)、水相微通道(3)、扩张角(8)相连通处形成通道交叉(4)；在通道交叉(4)处，水相微通道(3)与油相微通道(7)连通的一段是直管，直管且垂直于油相微通道(7)的B边；在通道交叉(4)处，水相微通道(3)和油相微通道(7)的连通口a与扩张角(8)与和油相微通道(7)的连通口b相对；连通口b的直径与连通口a的直径相等；

水相微通道(3)为蛇形结构；油相微通道(7)的直径等于水相微通道(3)的直径；优选出口通道(5)的直径是油相微通道(7)直径的2-10倍；进一步优选油相微通道(7)的直径和水相微通道(3)的直径为80-120μm；出口通道(5)的直径为200-300μm。进一步优选扩张角(8)的角度为120-150°。

上述数字PCR微滴的制备装置制备PCR微滴的方法，其特征在于，载体油从油相入口(1)进入油相微通道(7)后在A边进行分流，分别流入两侧的微通道，由于两侧的微通道直径相同，保证得到载体油的流速相同，减少微滴生成过程中由于流速变化造成的微滴大小不均匀；反应液从水相入口(2)进入后需经过水相微通道(3)后，从油相入口流入的载体油和从水相入口(2)流入的反应液会在通道交叉(4)处汇合，由于载体油纵向的剪切力和横向的粘性拉力生成微滴，然后进入出口通道(5)。

水相微通道(3)采用蛇形结构微通道的作用是减少外界干扰引起的反应液流速的瞬时改变，造成微滴生成不均匀，具有稳流作用，同时减小入口流速变化对微滴生成单分散性的影响，影响后续的检测结果。

微流控装置的设计主要针对数字PCR微滴生成这一特定问题，所述微通道包括水相入口通道、设置在水相入口通道后的蛇形稳流通道、油相入口通道、设置在油相入口通道后的分流通道、出口为锥形放大的油相与水相交汇通道以及微滴生成后的输出通道。

与油相入口通道相连的分流通道可以将油相平均分流到上下两个通道，保证两个通道内油相流速的一致性。

各通道通过连接器与外界相连。