[发明专利]一种检测耳聋基因的引物及其应用

说明书

本发明公开了一种检测耳聋基因的引物及其应用，具体的涉及SNP位点35delG的改进的高特异性的单碱基延伸引物，本发明同时提供了一种可以同时检测多个耳聋基因的试剂盒，该试剂盒采用多重PCR扩增引物和单碱基延伸引物，可在同管中同时检测多个热点突变，诊断快速、操作简单、成本低，有助于耳聋致病基因筛查的推广。

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种检测耳聋基因的引物及其应用。

背景技术

听觉系统中外耳、中耳、内耳结构异常及听觉传导信号通路中的听神经和各级中枢发生病变，导致听功能障碍，表现出不同程度的听力下降，统称为耳聋。耳聋的致病因素有很多，主要包括环境因素、遗传因素及环境-遗传相互作用。30％的遗传性耳聋除了耳聋外，还伴有其他异常，称为综合征型耳聋(SHI)。70％的遗传性耳聋可单独发生，称为非综合征型耳聋(NSHI)，但是往往伴有前庭功能障碍。

已知遗传性非综合征型耳聋有多种遗传方式，最常见的是常染色体隐性遗传(AR)，占75％～80％。虽然耳聋致病基因具有较高的基因和位点异质性，但大部分的耳聋是由少数几个基因的热点突变引起的，包括GJB2、GJB3、SLC26A4、线粒体基因(mtDNA12SrRNA)等，这使遗传性耳聋的基因诊断和筛查成为可能。

传统耳聋基因诊断方法包括限制性片段长度多态性分析(RFLP)、限制性内切酶酶切指纹-单链构象多态性分析(REF-SSCP)、变性高效液相色谱法(DHPLC)、实时荧光定量探针法、PCR结合Sanger测序。但是限制性内切酶的识别位点有限，针对特定的基因能检出的位点很少，导致检出率低，且反应条件严格，操作繁琐。DHPLC检测率高，对未知突变的检测准确率达95％以上，对已知突变大于99％，灵敏度高，但是不能检测纯合突变，且无法得出具体的突变类型和突变位点。实时荧光定量探针则价格昂贵，费时费力，灵敏度低。PCR结合Sanger测序被认为是突变检测的金标准，但是一般一次只能对一个基因或一个位点进行检测，导致耳聋患者的检出率不高。基因芯片是近年来发展起来的一种高通量、自动化的基因检测方法，让多基因、多位点同时检测成为可能，但基因芯片成本昂贵，技术要求高。因此，寻找一种能一次性检测多个基因热点突变、可靠、经济、快速的技术尤为重要。

随着生物技术的发展，多重PCR的应用使得同时检测多个突变位点成为可能，而引物的设计就尤为重要。但是采用常规方式进行引物设计时可能面对GC含量高引起错配的问题，现有技术中主要是采用避开GC含量高区域或者直接使用高GC含量区域的方法进行，但是避开高GC含量区域的方法不能解决某些位点没有调整的空间，直接使用容易引起引物非特异性结合，干扰检测。因此寻找一种有效设计引物的方法具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种引物，该引物可以特异性、灵敏的结合靶序列。

本发明的目的之二是提供一种设计引物的方法，使用该方法设计引物能够降低GC含量，提高引物的结合特异性。

本发明的目的之三是提供一种检测耳聋基因多态性的试剂盒，使用该试剂盒可以准确、快速、高通量、低成本的实现多个耳聋多态位点的的一次性检测。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种检测耳聋基因GJB2点突变的引物，所述突变点为35delG，所述引物包括PCR扩增引物和单碱基延伸引物，其中，PCR扩增引物的序列如SEQ ID NO.1～2所示，单碱基延伸引物序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明提供了一种设计引物的方法，使用A/T碱基替换连续G/C序列中的G/C。

进一步，所述的替换位于连续G/C的第三或第四个位置。在对相应的G/C替换后要保证引物3’端有2～3个碱基与模板链互补配对，并且分析替换后的引物扩增分析序列的特异性。