[发明专利]一种适用于产孢真菌核型分析的染色体DNA制备方法

权利要求书

1.一种适用于产孢真菌核型分析的染色体DNA制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)分生孢子收集：将产孢真菌进行液体培养后过滤菌液，得到分生孢子悬浮液，离心，用EDTA溶液洗涤2次，再将孢子悬浮在EDTA溶液中，制成浓度为2×10⁸/ml的分生孢子悬浮液；

(2)孢子琼脂糖块制备：将步骤(1)中分生孢子悬浮液与琼脂糖等体积混合制成孢子琼脂糖块，把孢子琼脂糖块放入3-4℃凝固10-15min；

(3)原生质体琼脂糖块制备：将步骤(2)中的孢子琼脂糖块放入酶液中，于36-37℃酶解3-4h，用无菌水洗涤2次；酶液配方为：破壁酶5-10mg/mL，NaCl0.6M，NaH₂PO₄ 8.4mM，Na₂HPO₄1.6mM，pH5.8；

(4)完整染色体琼脂糖块制备：将步骤(3)中酶解后的琼脂糖块放入NDS缓冲液中，于45-55℃水浴中裂解22-25h，重复1次；NDS缓冲液配方为：SDS 1-2％、蛋白酶K2mg/ml，Tris-HCl 1M，EDTA 0.5M，pH8.0；

(5)将步骤(4)中的琼脂糖块，用TE缓冲液在48-53℃下洗涤2次，每次0.8-1.4h，然后浸在TE缓冲液中并保存在4℃备用。

2.根据权利要求1所述的一种适用于产孢真菌核型分析的染色体DNA制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中EDTA溶液浓度为0.02-0.05M。

3.根据权利要求1所述的一种适用于产孢真菌核型分析的染色体DNA制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中琼脂糖先预冷至45-50℃，质量浓度1.4％，低熔点。

4.根据权利要求1所述的一种适用于产孢真菌核型分析的染色体DNA制备方法，其特征在于：所述破壁酶为溶壁酶。

5.根据权利要求1所述的一种适用于产孢真菌核型分析的染色体DNA制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中TE缓冲液配方为：EDTA 1mM，Tris-HCl 10mM，pH＝8.0。

6.根据权利要求1或5所述的一种适用于产孢真菌核型分析的染色体DNA制备方法，其特征在于：所述Tris-HCl的pH＝9.4。