[发明专利]一种快速鉴别检测血清4型禽腺病毒的双标记探针实时荧光PCR方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速鉴别检测血清4型禽腺病毒的双标记探针实时荧光PCR方法。该方法是通过以下步骤实现的：首先根据禽腺病毒基因组序列，设计一对引物FAV‑FQ‑F、FAV‑FQ‑R和探针P；然后提取FAV病毒DNA，采用超纯水溶解；最后采用设计的引物和探针进行实时荧光PCR检测。本发明提供的方法可快速灵敏准确地检测血清4型FAV，极大地缩短检测时间，可区分同期流行其他的主要血清型；同时避免了普通PCR的假阴/阳性情况，具有快速、准确、灵敏、重复性好等优点，可用于FAV样品的实验室检测。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种禽腺病毒的检测方法，具体涉及一种快速鉴别检测血清4型禽腺病毒的双标记探针实时荧光PCR方法。

背景技术

禽腺病毒（Fowl adenovirus，FAV）根据抗原性差异可以分为3个群，其中Ⅰ群是传统的禽腺病毒，包括从鸡分离到的12个血清型（FAV1-12）、火鸡2个血清型、鹅3个血清型和鸭2个血清型。禽腺病毒能引起包涵体肝炎、心包积液、肌胃糜烂等病变。自2015年6月开始，山东省部分地区的肉鸡中爆发了一种以死亡快、死亡率高、剖检以心包积液为主要病变特征的传染病。该病的传染速度很快，感染的宿主也扩大到蛋鸡、麻鸡、白羽肉鸡、三黄鸡、土鸡等品种。经鉴定，确定病原为Ⅰ群禽腺病毒。血清分型表明山东地区流行的禽腺病毒主要是血清4型和8a/b型，造成鸡群的死亡率较高，发病急、传播快。

荧光探针定量PCR（Real-time PCR）技术融汇PCR和DNA探针杂交技术的优点，直接探测PCR过程中荧光信号的变化。根据PCR反应的酶动力学特点，获得DNA模板的准确定量结果。该技术整个实验过程均在完全闭管的状态下进行，无需PCR后处理和冗长的电泳、紫外或染色检测，解决了常规PCR实验不能准确定量、操作繁复、污染环境等问题。Real-timePCR可以准确定量出0～10个拷贝的病原体，特异性强，定量范围极宽，具有重要的临床诊断价值。中国专利申请CN105907893A提供了一种荧光定量PCR检测试剂及其制备方法和应用，该方法采用的TaqMan-MGB探针价格比较昂贵，而且对AT含量高的序列设计有帮助，条件要求苛刻。

发明内容

本发明提供了一种快速鉴别检测血清4型禽腺病毒的双标记探针实时荧光PCR方法，该方法可快速灵敏准确地检测血清4型FAV，极大地缩短检测时间。

本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：

本发明提供了一种快速鉴别检测血清4型禽腺病毒的双标记探针实时荧光PCR方法，包括以下步骤：

（1）根据禽腺病毒基因组序列，设计一对引物FAV-FQ-F、FAV-FQ-R和探针P；

（2）提取待检FAV病毒DNA，采用超纯水溶解；

（2）采用设计的引物和探针进行实时荧光PCR检测。

进一步的，所述引物的序列为：

FAV-FQ-F，如SEQ ID NO1所示： 5'-CTAGGGTTCTGAACTTTG -3'，

FAV-FQ -R，如SEQ ID NO2所示：5'-CGGTAAACATTTCAAGGA-3'；

所述探针的序列为：

探针P，如SEQ ID NO3所示： 5'- (FAM）TGACGCCAGTTTCGCTTTCG (Eclipse) -3'。

进一步的，所述实时荧光PCR反应体系为：Premix Ex Taq™ (Probe qPCR) 12.5μL 、引物FAV-FQ-F (10 μM) 0.5μL、 引物FAV-FQ -R (10 μM) 0.5 μL 、Probe (5 μM) 1μL、 DNA 模板2μL、 ddH2O 8.5μL。