[发明专利]放线菌JY-22抗真菌成分分离方法及其在复配剂中的应用

权利要求书

1.放线菌JY-22抗真菌成分分离方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1：JY-22菌株发酵液抗真菌成分的初步提取，取菌株JY-22发酵液离心，收集上清液旋转蒸发得到浓缩发酵液，在浓缩发酵液中加入乙醇并沉降，离心后取上清液旋转蒸发得到二次浓缩液，然后用石油醚萃取二次浓缩液，再用正丁醇萃取二次浓缩液，最后收集正丁醇部分旋转蒸干，得到抗生素粗提浸膏；

S2：大孔树脂D101富集活性物质，将粗提浸膏用去离子水溶解后上样于装有大孔树脂的玻璃柱，静置吸附，依次用2-3倍柱体积的去离子水、浓度为30％-35％的乙醇、浓度为90％-95％的乙醇洗脱，收集90-95％乙醇的部分，减压旋转蒸干后用甲醇溶解得到粗提物A；

S3：硅胶柱层析分离活性物质，用适量甲醇溶解粗提物A得到样品一，然后按照200-300目硅胶与样品一的质量比例为1:1进行混匀伴样，然后按照硅胶与样品一的质量比例为45：1进行装柱，再以6-8份体积分数的甲醇、2-3份体积分数的氯仿、0.1-0.3份体积分数的氨水、剩下的以水补齐作为溶媒和流动相，然后用薄层板点板合并相同组分，再用抑菌圈法检测活性，收集活性组分得到粗提物B；

S4：SephadexLH-20柱层析，用适量甲醇溶解粗提物B得到样品二，将样品二缓慢加入装有聚糖凝胶LH-20的玻璃柱中，再用甲醇洗脱，薄层层析点板合并相同组分，抑菌圈检测活性，收集活性组分一后用体积比为(5-6)：(4-5)的甲醇和水的混合液溶解，缓慢加入装有葡聚糖凝胶LH-20的玻璃柱中，再用体积比为(5-6)：(4-5)的甲醇和水的混合液洗脱，用薄层层析点板合并相同组分得到粗提物C；

S5：高效液相色谱制备分离，对粗提物C进行液相分离，以变化浓度的甲醇与加入0.5％浓氨水的去离子水作为流动相，流动相洗脱条件:0-30min70％-80％甲醇，30-40min90％-95％甲醇，C18柱作为固定相，200-400nm检测，收集各个明显单峰，抑菌圈法检测活性；

S6：高效液相色谱分析，Shimadzu LC-20AD型高效液相色谱仪用Inertsil C18柱，洗脱剂选择甲醇和加入0.5％浓氨水的去离子水，流动相洗脱条件0-15min80％-85％甲醇，15-25min90％-95％甲醇，检测波长220nm，进样量12μL。

2.根据权利要求1所述的放线菌JY-22抗真菌成分分离方法，其特征在于：在S3步骤中的薄层板点板分析和抑菌圈法检测活性中，具体操作方法为：在标记各个斑点后，在超净工作台中进行操作，用少量石油醚涂布薄层板后，刮取各个斑点的硅胶，将硅胶置于涂有真菌孢子悬浮液的PDA培养皿内，培养观察抑菌圈，判断是否具有活性。

3.根据权利要求1所述的放线菌JY-22抗真菌成分分离方法，其特征在于：在S2步骤中，大孔树脂的预处理方法为：

用90％-95％乙醇浸泡大孔树脂，不断搅动使其充分溶胀，除去小的杂质及颗粒后装柱，再用90％-95％乙醇以2BV/h冲柱至流出乙醇不再混浊，之后再用去离子水以2BV/h的流速洗脱至流出液不再有白色且无乙醇味，用1mol/L-1.5mol/L2BV的HCL的溶液以4BV/h左右的流速通过树脂并浸泡3h，用去离子水洗至流出液PH中性，再同样用1mol/L-1.5mol/L的NaOH的处理洗至PH中性。

4.根据权利要求1所述的放线菌JY-22抗真菌成分分离方法，其特征在于：在S3步骤中，装柱前2d将200-300目硅胶按质量比加入10％-15％去离子水密封每隔段时间混匀一次，装柱采用湿法装柱，采用以6-8份体积分数的甲醇、2-3份体积分数的氯仿、0.1-0.3份体积分数的氨水、剩下的以水补齐作为溶媒，硅胶与样品比例＝45：1装柱，待柱子沉降压实完全后，将样品均匀铺在柱床表面，并覆盖2-3cm厚的硅胶层，并用以6-8份体积分数的甲醇、2-3份体积分数的氯仿、0.1-0.3份体积分数的氨水、剩下的以水补齐作为洗脱剂洗脱，每100mL收集一份，薄层板点板合并相同组分，抑菌圈法检测活性，确定活性组分。

5.根据权利要求1所述的放线菌JY-22抗真菌成分分离方法，其特征在于：S4步骤中，葡聚糖凝胶LH-20在装柱前用甲醇洗脱充分溶胀，容器中甲醇体积大于凝胶体积，溶胀过程搅拌除去凝胶中的气泡，避免过分搅拌破坏凝胶粒表面，静置过夜，溶胀后装柱，将甲醇与凝胶的混悬液加入100cm×1cm的玻璃柱中，使凝胶沉降均匀完全。