[发明专利]一种利用固有荧光核苷酸超灵敏同时检测多种DNA糖基化酶的方法

说明书

本发明公开了一种利用固有荧光核苷酸超灵敏同时检测多种DNA糖基化酶的方法。本发明通过2‑氨基嘌呤和吡咯‑脱氧胞苷作为荧光基团，DNA分子作为固有猝灭剂，结合外切酶协助的循环信号放大同时检测多种DNA糖基化酶的快速、灵敏的荧光方法，不需要额外的荧光基团和猝灭基团标记，不仅达到实现简单、直观、高灵敏度、检测实际样本的目的，更重要的是实现了多种DNA糖基化酶同时检测。

技术领域

本发明涉及DNA糖基化酶检测技术领域，具体涉及一种利用固有荧光核苷酸超灵敏同时检测多种DNA糖基化酶的方法。

背景技术

内源性DNA损伤是各种内部和环境因素作用的结果，会引起DNA突变和复制错误，进一步引发癌症。碱基切除修复(BER)是处理由氧化、烷基化和脱氨基所引起的内源性DNA碱基损伤的主要修复途径。BER通路由DNA糖基化酶引发，它可以催化损伤/错配碱基的切割，并产生作用于下游BER修复过程的脱嘌呤/脱嘧啶位点。

DNA糖基化酶的异常表达与人类疾病密切相关，对DNA糖基化酶的准确检测对于了解DNA损伤修复过程和临床诊断有重要意义。传统的DNA糖基化酶检测方法中，放射性标记的方法灵敏度偏低，而且同位素标记探针会引起放射性污染；凝胶电泳方法灵敏度低，需要样品量大，对操作技巧要求高，不适合定量分析；酶联免疫吸附法和免疫印迹法需要与蛋白结合的特异性抗体，操作步骤繁琐。色谱法定性能力较差，当被分离物极性相差较小时分离效果不好，洗脱时使用溶剂较多，造成溶剂浪费；链霉亲和素顺磁珠捕获技术需要分离步骤，操作程序复杂，无法进行均相检测，并且标记较为昂贵。荧光方法具有安全、简单、灵敏度高的独特优点。然而，荧光方法依赖于用荧光团和猝灭剂进行外部标记，用于均相测定，涉及到复杂的设计且费用高。此外，目前所报道的荧光方法仅能检测到单一类型的DNA糖基化酶。事实上，所有的哺乳动物会表达多种DNA糖基化酶来维持基因组的稳定，每种DNA糖基化酶具有底物特异性。多种DNA糖基化酶，如hOGG1和UDG，都参与BER途径处理内源性DNA碱基损伤，而hOGG1和UDG的异常表达对于分析多种类型的癌症具有深刻的意义。因此，开发同时检测多种DNA糖基化酶的方法，能为解释DNA损伤修复过程和提高早期临床诊断准确性提供新机会。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种利用固有荧光核苷酸超灵敏同时检测多种DNA糖基化酶的方法。

本发明通过2-氨基嘌呤(2-AP)和吡咯-脱氧胞苷(P-dC)作为荧光基团，DNA分子作为固有猝灭剂，结合外切酶协助的循环信号放大同时检测多种DNA糖基化酶的快速、灵敏的荧光方法，不需要额外的荧光基团和猝灭基团标记，不仅达到实现简单、直观、高灵敏度、检测实际样本的目的，更重要的是实现了多种DNA糖基化酶同时检测。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种用于同时检测多种DNA糖基化酶的探针组合，包括：双功能DNA探针、触发探针1、触发探针2、2-AP信号探针和P-dC信号探针；

所述双功能DNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

触发探针1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

触发探针2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

2-AP信号探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

P-dC信号探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明的第二方面，提供上述探针组合在制备同时检测多种DNA糖基化酶的试剂盒或芯片中的用途。

本发明的第三方面，提供一种同时检测多种DNA糖基化酶的试剂盒，该试剂盒中包含上述的探针组合。

进一步的，本发明的试剂盒中还包括：反应缓冲液、Nb.BtsI内切酶和Lambda核酸外切酶。