[发明专利]用于纯化重组ADAMTS13和其它蛋白质的方法以及其组合物

权利要求书

1.一种用于将具有1型凝血酶敏感蛋白基序的重组解整合素样金属肽酶13(ADAMTS13)蛋白质从包含ADAMTS13蛋白质和非ADAMTS13杂质的样品中纯化的方法，所述方法包括两个串联的色谱步骤：

第一步包括：在使得所述ADAMTS13蛋白质出现于由羟基磷灰石所得的流过馏分中的条件下，用色谱法使所述样品与所述羟基磷灰石接触，其中所述ADAMTS13蛋白质不与羟基磷灰石结合，而所述非ADAMTS13杂质得以保留在所述羟基磷灰石上；和

第二步包括：随后用色谱法使所述流过馏分与结合ADAMTS13蛋白质的混合模式阳离子交换/疏水性相互作用树脂接触；和

用洗脱缓冲液将所述ADAMTS13蛋白质从混合模式阳离子交换/疏水性相互作用树脂上洗脱。

2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在用色谱法与所述羟基磷灰石接触之前，用色谱法使所述样品与阴离子交换树脂接触并将所述ADAMTS13蛋白质从所述阴离子交换树脂上洗脱。

3.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在用色谱法与所述羟基磷灰石接触之前，通过超滤来浓缩所述样品中的所述ADAMTS13蛋白质；和通过渗滤交换到包含钙离子和锌离子的缓冲液中来使所述ADAMTS13蛋白质稳定。

4.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在与所述羟基磷灰石或所述混合模式阳离子交换/疏水性相互作用树脂接触之后，通过降低缓冲液电导率来制备所述ADAMTS13蛋白质以便进行阳离子交换的制备步骤。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述制备步骤是通过超滤/渗滤来进行。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述制备步骤是通过渗析来进行，所述渗析由通过单个渗析模块的不超过2次操作组成。

7.根据权利要求4所述的方法，其中所述制备步骤是通过凝胶过滤来进行。

8.根据权利要求1或4所述的方法，其进一步包括使所述ADAMTS13蛋白质进行至少一个病毒灭活或病毒清除步骤。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述病毒灭活步骤包括向所述ADAMTS13蛋白质添加包含非离子型清洁剂和有机溶剂的溶剂-清洁剂混合物，

所述溶剂-清洁剂混合物是适用于使脂质包膜病毒灭活的溶剂-清洁剂混合物。

10.根据权利要求9所述的方法，其中在用溶剂-清洁剂混合物处理所述ADAMTS13蛋白质之前，将所述ADAMTS13蛋白质固定于载体上，

所述载体选自下组：树脂、载玻片、珠粒、基质或膜。

11.根据权利要求10所述的方法，其中将所述ADAMTS13蛋白质固定于阳离子交换树脂上；或所述ADAMTS13蛋白质通过载体上的基团和蛋白质上的基团之间的键而被固定。

12.根据权利要求9所述的方法，其中所述溶剂-清洁剂混合物包含1％TRITONX-100、0.3％磷酸三正丁酯和0.3％吐温80。

13.根据权利要求8所述的方法，其中所述病毒清除步骤包括用纳滤器过滤所述ADAMTS13蛋白质以清除病毒和/或病毒颗粒。

14.根据权利要求4所述的方法，进一步包括使所述ADAMTS13蛋白质进行至少一个病毒灭活或病毒清除步骤，其中所述病毒灭活或病毒清除步骤在所述制备步骤之后进行。

15.根据权利要求11所述的方法，其进一步包括使用梯度洗脱将所述ADAMTS13蛋白质从所述阳离子交换树脂上洗脱，所述梯度洗脱包括使用具有低盐含量的第一缓冲液和具有较高盐含量的第二缓冲液。

16.根据权利要求11所述的方法，其进一步包括使用分步洗脱将所述ADAMTS13蛋白质从所述阳离子交换树脂上洗脱。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述分步洗脱包括使用存储缓冲液将所述ADAMTS13蛋白质从所述阳离子交换树脂上洗脱，

其中所述存储缓冲液包含300mM NaCl、2mM CaCl₂、20mM组氨酸、0.05％吐温80，pH为7.5。

18.根据权利要求17所述的方法，其中没有后续的浓缩或缓冲液更换步骤。