[发明专利]S-2765凝血检测发光底物的肝素含量的测定方法

说明书

本发明公开了一种S‑2765凝血检测发光底物的肝素含量的测定方法，其包括待测样品的处理、标准曲线的制作与样品的测定三个部分。待测样品的处理方法为稀释与加热处理，标准曲线的制作与样品的测定采用微量发色底物法。本发明利用微量发色底物法进行测定，具有灵敏度高，操作简单、省时，检测所需试剂用量小等优点；通过60～80℃加热处理待检样品抗凝血酶‑Ⅲ浓缩物20～50min，能够灭活待检样品中对结果造成很大影响的抗凝血酶‑Ⅲ成分，但不会对肝素的活性产生影响，提高了测定结果的准确性；采用绘制标准曲线计算结果，稳定性、准确性高。

技术领域

本发明属于生物学检测技术领域，具体涉及一种S-2765凝血检测发光底物的肝素含量 的测定方法。

背景技术

人抗凝血酶-Ⅲ(antithrombin-Ⅲ，AT-Ⅲ)浓缩物是从人血浆中分离纯化得到的血浆蛋 白制品，主要用于治疗各种原因引起的抗凝血酶-Ⅲ缺乏症及手术造成的血栓等。目前，抗凝 血酶-Ⅲ的纯化制备工艺以利用肝素亲和层析为主要步骤，在纯化的过程中，会发生层析填料 中的肝素脱落，因此，要对抗凝血酶-Ⅲ浓缩物中的肝素含量进行检测。欧洲药典第7版 (European Pharmacopoeia 7.0，EP7.0)和美国药典第32版(United StatesPharmacopeia 32， USP32)对抗凝血酶-Ⅲ浓缩物的要求为每国际单位(IU)抗凝血酶-Ⅲ中肝素含量不超过 0.1IU。

发色底物(chromogenic substrates)为化学合成的小肽，其一端为发色基团(pNA)。特 定的酶(如凝血酶)可将pNA催化解离下来。游离pNA可通过分光光度计或酶标仪检测， 从而确定相应物质的活性。常见的发色底物有：凝血酶发色底物S-2238，FXa发色底物S-2765 和S-2222。发色底物法(chromogenic assays)是目前主要的肝素效价检测方法，是欧洲药典 (EP)和美国药典(USP)中规定的肝素(特别是低分子肝素)检测方法。该方法也广泛用 于实验室研究和体外诊断。通过控制反应体系的条件，发色底物法可检测凝血因子、辅因子 或凝血因子抑制剂。

目前肝素的含量测定多采用凝固法和发色底物法，其检测基本原理均基于肝素与抗凝血 酶-Ⅲ结合能够灭活凝血因子或抑制凝血反应。

凝固法操作复杂、耗时，发色底物法具有灵敏度高，操作简单、省时，检测所需试剂用 量小等优点。在发色底物法中，绘制标准曲线计算结果的方式较采用的单一对比计算具有更 高的稳定性和准确性。由于待测样品的特殊性，与肝素标准品相比，其含大量抗凝血酶-Ⅲ， 在测定反应中会促进对凝血因子的灭活反应，进而影响测定结果的准确性。

肝素含量测定法为凝固法，以血浆与高岭土、脑磷脂混合物复钙化后的凝固反应为检测 体系，利用硫酸鱼精蛋白能够中和肝素从而影响检测体系凝固时间为原理进行测定，但该方 法并不适用于抗凝血酶-Ⅲ浓缩物。截至目前，还没有相关专门针对抗凝血酶-Ⅲ浓缩物中肝 素含量检测方法的研究报道。

发明内容

本发明目的在于针对以上所述测定技术中存在的样品抗凝血酶-Ⅲ的干扰大、测定准确性 不高等技术问题，提出一种新的S-2765凝血检测发光底物的肝素含量的测定方法。首先根 据肝素具有比抗凝血酶-Ⅲ热耐受性高的特点，设计采用高温加热处理的方法使待测样品中抗 凝血酶-Ⅲ失活，进而消除其对测定结果的影响；其次，采用微量发色底物法，通过绘制标准 曲线，对待测样品肝素含量进行计算。

本发明所采用的技术方案为：

一种S-2765凝血检测发光底物的肝素含量的测定方法，其中，包括待测样品的处理、 标准曲线的制作与样品的测定三个部分；其操作步骤为：

A、待测样品的处理：

用0.03mol/L Tris缓冲液将已知效价的抗凝血酶-Ⅲ浓缩物样品稀释至抗凝血酶-Ⅲ浓度为 1IU/ml，70～80℃高温水浴处理30～50min；