[发明专利]利用生物反应器生产猪伪狂犬病活疫苗的方法及其制品

说明书

本发明属于兽用生物制品技术，具体涉及一种利用生物反应器生产猪伪狂犬病活疫苗的方法及其制品。本发明所用制苗用细胞为Vero细胞，并且Vero细胞由无血清添加的细胞生长液培养得到，且在病毒培养过程中所用细胞维持液同样也无血清添加，保证了产品的质量均一稳定和产量；获得的猪伪狂犬病毒活疫苗效价高，性质稳定。

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术，具体涉及一种利用生物反应器生产猪伪狂犬病活疫苗的方法及其制品。

背景技术

猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病病毒引起一种急性传染病。该传染病遍布世界主要养猪国家。免疫接种是预防猪伪狂犬病的主要措施。我国目前生产猪伪狂犬病活疫苗所用的细胞未鸡胚成纤维细胞和ST细胞。由于每批鸡胚原材料的差异，使得鸡胚成纤维原代细胞的批间差异大；用鸡胚成纤维细胞培养猪伪狂犬病病毒的病毒滴度不高，给疫苗产量、效力的提高带来困难，而且细胞碎片与杂蛋白多，容易引起过敏反应。

当前猪伪狂犬病活疫苗的生产主要是转瓶细胞培养的传统培养方式和用ST细胞生物反应器培养，转瓶培养方式是培养细胞贴壁生长于玻璃瓶的内壁上，虽然其操作技术要求较低和技术成熟稳定；但转瓶培养技术已经使用数十年，与当前大规模动物疫苗生产不相适应，主要表现为：(1)转瓶细胞培养，不能做到培养条件适时调整，无法保证细胞培养处于最佳条件，培养细胞密度小，培养病毒滴度低，动物的免疫效果较差；(2)转瓶细胞培养，细胞碎片与杂蛋白多，疫苗的杂质多，导致免疫动物副反应大；(3)转瓶细胞培养，细胞批间差异大，产品质量不均一、不稳定；(4)转瓶细胞培养，生产效率低，生产成本高。

中国专利申请(CN101695572A)公开了一种利用生物反应器生产伪狂犬病活疫苗的方法及其制品。将生物反应器和微载体经消毒后接种所述制苗用细胞，并加入细胞生长液进行培养。将所述生物反应器接种所述含伪狂犬病病毒弱毒种的维持液，继续培养。接毒后2～3日收获细胞培养毒液，并加入稳定剂和抗生素，经冷冻真空干燥得到伪狂犬病活疫苗。其中，其选择制苗用的细胞系为猪睾丸(ST)细胞系，猪肾(PK15)细胞系和猪肾(IBRS-2)细胞系。并且在细胞生长液和维持液中均使用犊牛血清。而上述所用的细胞系和犊牛血清，往往容易携带外源病毒且不同批次间产品质量不易控制，从而对生产猪伪狂犬病活疫苗有很大的影响。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种利用生物反应器生产猪伪狂犬病活疫苗的方法。本发明所用制苗用细胞为Vero细胞，并且Vero细胞由无血清添加的细胞生长液培养得到，且在病毒培养过程中所用细胞维持液同样也无血清添加，保证了产品的质量均一稳定和产量。

本发明通过以下技术方案实现：

一种利用生物反应器生产猪伪狂犬病活疫苗的方法，包括以下步骤：

S1.用细胞生长液培养制苗用细胞，待细胞密度达1.0x10⁶～1.5x10⁶个/mL，接种到含有15～20g/L微载体的无菌生物反应器内培养；

S2.待所述步骤S1制苗用细胞培养4～5天，密度达到1.2x10⁶～1.5x10⁶个/mL接种猪伪狂犬病病毒弱毒株，将反应器温度调至36℃～38℃，并加入细胞维持液进行繁殖培养；

S3.在所述步骤S2得到的细胞培养液中加入稳定剂和抗生素，经冷冻真空干燥得到猪伪狂犬病活疫苗。

优选地，所述制苗用细胞为Vero细胞，猪伪狂犬病病毒弱毒株为Bartha-K61弱毒株。