[发明专利]一种基于三维皮肤模型和树突状细胞共培养模式的皮肤致敏检测方法在审

专利信息
申请号: 201710439870.2 申请日: 2017-06-12
公开(公告)号: CN107446993A 公开(公告)日: 2017-12-08
发明(设计)人: 程树军;秦瑶;陈彧;柯逸晖 申请(专利权)人: 程树军;广州市华代生物科技有限公司
主分类号: C12Q1/68 分类号: C12Q1/68;G01N33/50;G01N33/53;G01N15/14
代理公司: 广州知友专利商标代理有限公司44104 代理人: 周克佑
地址: 510623 广东省*** 国省代码: 广东;44
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摘要:
搜索关键词: 一种 基于 三维 皮肤 模型 树突 细胞 培养 模式 检测 方法
【说明书】:

技术领域

本发明属于皮肤致敏物质毒性检测和研究技术领域,具体涉及一种基于三维皮肤模型和树突状细胞共培养模式的皮肤致敏检测方法。

背景技术

皮肤致敏,亦称之为接触性过敏性皮炎(Allergy Contact Dermatitis,ACD),是皮肤对外源性物质产生的免疫原性皮肤反应。皮肤致敏的临床表现有瘙痒、红斑、丘疹和水肿等症状。对于大量生产的工业化学品,法规要求对其可能导致的皮肤致敏性进行检测;同样,对于可能皮肤接触的产品,包括化妆品、消毒类产品、卫生用品和医疗器械等,也应当对其可能引起的皮肤致敏进行评估检测。传统的方法采用豚鼠实验,通过诱导和激发两个阶段在动物皮肤涂抹受试物质,观察引起的皮肤症状进行判定,不仅需要大量标准化的实验动物,而且实验周期长,带给动物极大的痛苦。随着3R原则的推行,2004年OECD发布了小鼠局部淋巴结实验(LLNA),以致敏发生后淋巴结内T细胞数量增殖变化代替动物临床症状观察,虽然减轻了动物痛苦,但仍然需要使用大量动物。近年来,在有害结局通路(Adverse Outcome Pathway,AOP)毒性测试理念的指导下,快速高效的体外检测方法得到开发。其中皮肤致敏的体外预测方法开发最受关注。

接触性过敏性皮炎属于人类的IV型超敏反应,基于有害结局通路(AOP)反应原理的皮肤致敏过程可分为:(1)外源物质渗透进入皮肤;(2)化学物质与表皮中的蛋白质结合,形成半抗原-蛋白复合物;(3)角质细胞氧化反应通路启动;(4)皮肤中的树突状细胞识别复合物,启动特异性反应;(5)成熟树突状细胞传递信号激活T淋巴细胞,产生记忆T细胞;(6)再次接触同类物质,淋巴结中的记忆T细胞快速增殖,产生特异性反应,皮肤出现相关症状。

外源物质引起人体皮肤致敏的发生需要诱导和激发两个阶段,传统动物实验完整地模拟了这一现象。基于目前对于致敏发生机制的深入了解,可以针对上述过程的第(1)-(3)步建立检测方法。例如,针对第(2)步外源化学物质与表皮蛋白结合,建立了直接多肽结合反应(DPRA方法),针对表皮细胞的第(3)步,有学者利用EpiskinTM完成了皮肤致敏体外方法的建立(Francoise C,Elodie B,Claude A,et al.Genes specifically modulated in sensitized skins allow the detection of sensitizers in a reconstructed human skin model.Development of the Sens-IS assay.Toxicology in Vitro,2015,29:787-802),针对第(4)步致敏物激活树突状细胞,建立了人免疫细胞活化实验(h-CLAT方法)。针对第(5)步体外T细胞检测,2013年6月26日M.林德斯泰特等人申请了有关专利(中国专利申请号201180062886.7),该发明包括基于MUTZ-3细胞和基因阵列的皮肤致敏检测方法等。但是,这些方法仅仅只是针对皮肤致敏AOP过程中某一关键步骤建立的单一检测方法。然而人体皮肤并非简单地分解为各种细胞的组合,需要整合各个独立的细胞事件,最大化的利用检测过程中产生的所有毒理信息,获得完整的评估。所以,基于三维结构皮肤模型和树突状细胞的方法可用简单的系统,提供更全面和更科学准确的皮肤致敏反应信息。

发明内容

本发明所要解决的技术问题,就是提供一种基于三维皮肤模型和树突状细胞共培养预测皮肤致敏的方法,利用体外的检测技术,完全不需要动物进行测试,更具代表性的使用了人源细胞,可以更接近人体的检测系统,高效和快速的进行毒性检验。

解决上述技术问题,本发明所采用的技术方案如下:

一种基于三维皮肤模型和树突状细胞共培养模式的皮肤致敏检测方法,其特征是包括以下步骤:

步骤1.皮肤模型前期制备;

步骤2.树突状细胞的制备与培养;

步骤3.皮肤模型与树突状细胞共培养构建和受试物暴露:

将购置或自制的皮肤模型孵育在一个与之大小匹配的6孔、12孔或24孔培养皿中:如果皮肤模型为吊篮式,将其直接悬挂于培养皿壁;如果皮肤模型为插入式,直接将其置于培养皿内;

培养皿中已经添加2mL含酚红的MEM培养基,但无细胞;

孵育在温度为37.5±0.5℃、湿度90±8%和5±1%CO2的培养箱环境中,时间为12-24h,备用;

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