[发明专利]纯化核酸的结合液及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及纯化核酸的结合液及其应用。

背景技术

经典的分离纯化核酸方法是在高浓度离液盐的作用下将目标核酸分子吸附在硅基质膜上，而非目标核酸、蛋白质、盐类以及有机物质则不吸附，从而达到分离纯化的目的。该方法依据纯化的目的不同可以分为两类：直接纯化法与切胶回收法，其中直接纯化法适用于产物为单一DNA片段或者溶液中所有DNA片段都需要回收的情况；而切胶回收法适用于选择性回收溶液中DNA的情况。从待分离核酸的分子特征方面而言，硅基质膜吸附分离又可以分为三类：基于核酸分子的大小、核酸分子的拓扑异构状态以及核酸分子中的化学基团分离。此外，还有一种被广泛应用的方法，即聚乙二醇沉淀法，其原理是在聚乙二醇为基础的缓冲体系作用下，将不同大小的DNA片段选择性沉淀，从而将它们分离开的方法。此方法所使用的聚乙二醇浓度高时不易被漂洗干净，存在对下游实验造成抑制的风险。

上述方法操作不仅费时费力，还存在对下游实验造成抑制的风险，并且往往不能与高通量的自动化机器相匹配。目前，伴随着二代测序技术的逐步发展，为了匹配高通量的平行测序数据的输出，构建大量的测序文库是必需的操作环节。而文库构建过程中的背景去除又是保证高质量测序数据的必要步骤，这些干扰测序读码的背景主要包括：单个接头分子以及接头自连的分子，这类背景分子比正常的加有接头的目标DNA片段小，在测序之前必须被去除掉，否则会严重干扰测序信号。由此可见，简洁、快速、高效的且可以整合到二代测序文库构建过程中的小片段去除方法是非常必需的。

然而，现有分离纯化核酸方法仍有待改进。目前，逐渐发展起来了磁珠吸附法。该方法操作简单方便，将DNA产物在适宜的结合液作用下与磁珠颗粒结合，在磁场条件下将磁珠颗粒与溶液分离开来，不同的结合液作用使得不同的目标DNA片段与磁珠结合，而其它非目标片段则留在溶液中被弃掉，进一步对结合有目标片段DNA的磁珠进行漂洗，最后洗脱下所需要的DNA，最终达到与非目标片段分开的目的。

以往的发明CN101665785 A、CN103820431A、CN101684138 A公开的都是采用磁珠从样本中提取与纯化核酸的方法，强调裂解样本，并从中获取核酸。而本发明不涉及从样本中提取，而是采用磁珠吸附的原理，将不同大小的DNA片段分离开来，后续用于相应的分子生物学试验。专利CN 104560954 A公开了一种基于磁珠法纯化非特异性扩增聚合酶链式反应(PCR)产物的方法，此发明通过琼脂糖凝胶电泳首先将目的条带与非特性扩增条带分离开，然后将目的条带用小刀切下，再通过磁珠法来纯化PCR产物，与传统方法相比，其优点在于实现了自动化，不需要离心，简单快捷。而本发明所提出的通过磁珠吸附的原理将大小不同的DNA片段分开的方法，不需要进行琼脂糖凝胶电泳，省去电泳与切胶溶胶的时间与步骤，直接将产物通过磁珠法纯化回收即可得到目标DNA。

本发明所涉及的方法主要特点在于不涉及裂解样本并从中提取核酸，也不需要琼脂糖凝胶电泳以及切胶溶胶的过程，可以通过调整磁珠结合液的浓度，浓度越高结合的DNA片段大小的范围越宽，浓度越低则只结合大片段，小片段则游离在上清中，依据此原理将不同大小的DNA片段分离开来，这一点也是目前检索专利未曾提到的。另外，值得强调的一点是本发明所涉及的方法可以用于微量核酸的纯化，主要针对无创产前筛查过程中所提到的微量循环核酸，在二代测序前需要进行一系列的建库反应，每步反应后都需要进行产物纯化去除相应的背景信号，才能进行下一步实验。这一点也是以往专利中未提到的。

发明内容

本发明是发明人基于以下发现所获得的：

发明人基于磁珠吸附的原理，使得目标DNA产物在适宜条件的结合液作用下与磁珠颗粒相结合，而低于目标DNA的小片段以及其它蛋白质、盐类与有机物质等不被吸附，将分子量低于目标DNA的小片段以及其他杂质分离去除的方法，从而达到分离纯化目标核酸的目的。

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的问题之一。