[发明专利]一种三角褐指藻双功能酶及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程及代谢工程领域，特别涉及一个三角褐指藻双功能酶(蜡酯合成酶/二脂酰甘油酰基转移酶)及其应用。

背景技术

随着全球经济一体化的不断发展，世界能源形势日趋紧张，大量使用石油燃料使得能源危机和环境问题日益突出，寻找一种可持续发展的新能源，成为各国关注的问题。生物柴油作为绿色可持续发展的新能源，受到越来越多的关注。我国工业化生物柴油目前主要还是以大豆和油菜籽等油料作物、油棕和麻风树等油料木果实以及动物油脂、废餐饮油等为原料制备。原料虽然多样，但来源是非常有限的，就算把它们加起来也难以满足人类对燃油的需求，因此寻找新一代的生物柴油原料已经迫在眉睫。而微藻因易于培养、具有单位面积产量大等优点，被视为新一代的、甚至是唯一能实现完全替代石化柴油的生物柴油原料。

微藻生物柴油生产的一大难题是藻种的选育。微藻种类繁多，不同藻种的脂质含量和组成差异巨大，要从这些微藻中筛选出藻油含量高并适合当地环境培养的藻种，是非常繁杂的工作。在众多育种方式中，利用基因工程手段进行分子定向育种，较诱变育种及生理调控方式具有高效、直接、可稳定遗传等特点。

三角褐指藻是硅藻门、羽文藻纲、褐指藻属的一种单细胞浮游藻种，脂质含量达细胞干重的20-30％，是微藻生物柴油开发的优良藻种。但是其脂质含量距离生产工艺开发尚有距离，选育油脂含量更高的藻种是首要条件。

三角褐指藻的基因组序列已经公布，目前已经发现油脂合成途径的多个关键酶基因，可用作基因工程的靶点；同时三角褐指藻的基因工程研究起步较早，已经建立了稳定高效的遗传转化体系。在此基础上，利用基因工程的技术手段，对三角褐指藻油脂合成途径的关键酶基因进行操作，选育油脂含量提高的优良藻株，是一种直接、高效且简便可行的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种三角褐指藻的双功能酶蜡酯合成酶/二脂酰甘油酰基转移酶及其应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种三角褐指藻双功能酶，三角褐指藻双功能酶为蜡酯合成酶/二酯酰甘油酰基转移酶，其氨基酸残基如序列表中SEQ ID No:1所示；

或，与序列表SEQ ID No:1所示氨基酸具有90％以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的序列。

所述编码蜡酯合成酶/二酯酰甘油酰基转移酶的基因序列的碱基序列如SEQ ID No:2所示。

三角褐指藻的双功能酶蜡酯合成酶/二脂酰甘油酰基转移酶，命名为PtWS/DGAT，来源于硅藻门、褐指藻属的三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)，氨基酸序列如SEQ ID No:1所示，是由504个氨基酸残基组成的蛋白质。

编码本发明的三角褐指藻双功能酶蜡酯合成酶/二脂酰甘油酰基转移酶基因如序列表中SEQ ID No:2的DNA序列，由1515个碱基组成，不含内含子结构。

一种三角褐指藻双功能酶，所述三角褐指藻双功能酶在选育微藻突变株中的应用；

或，所述三角褐指藻双功能酶在生物柴油生产中的应用。

具体是将三角褐指藻双功能酶蜡酯合成酶/二脂酰甘油酰基转移酶基因导入油脂缺陷型酵母及细菌中表达，鉴定该酶的功能：将该基因插入酵母表达载体pYES2中，利用热激法导入油脂缺陷型酵母H1246中，H1246-PtWS/DGAT酵母突变株恢复合成油脂的能力，其总脂含量提高3倍，油脂含量提高4.3倍；将该基因插入细菌表达载体pET28a中，导入大肠杆菌BL21(DE3)中表达，大肠杆菌突变株BL21-PtWS/DGAT较BL21脂质含量增加2.6倍，油脂含量增加3.5倍。

一种三角褐指藻突变株，突变株于2017年5月9号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，编号为CGMCC No.13870，分类名称为三角褐指藻，拉丁名为Phaeodactylum tricornutum。

一种三角褐指藻突变株的构建方法，将克隆蜡酯合成酶/二酯酰甘油酰基转移酶的基因导入三角褐指藻细胞中过表达，而后经筛选，并进行继代培养，进而获得保藏编号为CGMCC No.13870的三角褐指藻突变株。

所述过表达后的三角褐指藻细胞在含有30μg/ml除草剂草丁膦和100μg/ml卡那霉素的f/2固体平板上进行连续5代以上筛选。

所述三角褐指藻突变株具体的筛选过程：

1)从三角褐指藻中提取总RNA，并反转录为cDNA，以此为模版，克隆蜡酯合成酶/二酯酰甘油酰基转移酶的基因，并将其导入三角褐指藻中过表达；