[发明专利]一种牙周膜干细胞的冻存液及其冻存方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞冻存领域，尤其涉及一种牙周膜干细胞的冻存液及其冻存方法。

背景技术

牙周疾病不仅是引起成年人失牙的主要原因，还是危害人类口腔乃至全身健康的主要口腔疾病。牙周病是牙周组织的慢性炎症刺激下的感染性疾病，是牙菌斑中的微生物在相应的微环境下引起的炎症，它损坏牙周组织，尤其是牙槽骨的破坏和牙周组织的丧失，最终导致牙齿松动脱落以及牙槽骨的吸收。而牙周治疗的目标就是要治疗牙周炎症，改善微环境重新再生出新的结缔组织附着和支持组织，完成牙槽骨，牙骨质和牙周膜的构建。常用的牙周再生方法有引导组织再生术、根面平整术等，此类方法简单易行但并不能完全实现功能性和结构性牙周组织再生，存在相应的局限性。牙周组织工程技术的出现和发展为牙周再生提供了崭新的思路和方法。

牙周膜是牙根与牙槽骨之间的一层结缔组织，是重要的牙周支持组织，主要由成纤维细胞、成牙骨质细胞和一些未分化的间充质细胞组成。正常情况下，牙周组织具有自身的更新和修复能力，其修复活动是通过牙周膜细胞自我更新实现的。在疾病或在受到外界刺激时，通过牙周膜中细胞的不断增殖和分化使组织再生。2004年Seo等从拔除的第三磨牙牙周膜组织中分离得到牙周膜干细胞(Periodontal Ligament Sem Cells，PDLSCs)。此外，在拔牙后牙槽窝的内表面也有PDLSCs存在。近来，有人从成人牙周组织中得到了高度纯化的PDLSCs克隆。值得注意的是，更多研究发现，从炎症牙周膜组织中也可分离得到PDLSCs，并证明其仍保持再生牙骨质和牙周膜组织的潜能，也在一定程度弥补了其来源不足的弊端。研究表明，PDLSCs表达间充质干细胞的标记物STRO-1和CD146/MUC18，这意味着PDLSCs很有可能是来源于血管周围的细胞群。而这一点恰恰与同样表达STRO-1和CD146/MUC18的骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMMSCs)非常相似。PDLSCs也具有与BMSCs相似的多向分化能力，可体外分化为多种细胞，如脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞等，在维持牙周组织的稳态，维护牙槽骨的新陈代谢过程中发挥了重要作用。

虽然有研究采用包括脂肪、骨髓在内的多种组织来源的成体干细胞进行牙周再生，但取材的有创性和伦理性等问题仍然制约了其发展。因此，PDLSCs有望成为牙周组织再生的首选种子细胞。

近几年，干细胞库建立的需要以及临床上对干细胞的需求增加，对干细胞冻存与复苏方面的研究引起了越来越多的关注。与其他来源MSCs一样，PDLSCs作为组织工程学研究和潜在临床应用的种子细胞，其过度传代会表现明显衰老或凋亡，且长期体外培养易发生自发分化，失去多分化潜能，增殖、黏附能力下降，细胞凋亡率增加，所以冻存PDLSCs也是其研究应用的重要环节之一。

细胞冻存液是一种细胞冻存时使用的溶液，它可以供给细胞生命代谢所必须的营养物质，同时可以防止或减少冷冻冰晶对细胞的损伤作用。目前常用的细胞冻存液或市售的细胞冻存液中通常是由二甲基亚砜(dimathyl sulfoxide，DMSO)和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)混合组成。DMSO是一种分子量小，且具有强溶解能力和渗透能力的化学物质。在许多研究中，DMSO是最常用的细胞冻存保护剂，用其保存的细胞复苏后与新鲜细胞比较，具有相似的表型、细胞表面标记及生长速率。DMSO的作用机制是在降温过程中透过细胞膜进入细胞内，降低细胞内、外未结冰溶液中电解质浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质损伤，同时细胞内水分不会过度外渗，避免细胞过度脱水皱缩。然而，DMSO对细胞有一定毒性作用，浓度过高会引起较高的渗透压，不利于细胞复苏。因此，目前DMSO常规使用浓度为5％-15％。FBS属于异源性物质，成分复杂，并存在引入污染和过敏原的风险，不适合于临床应用。特别是在细胞治疗中，异源性蛋白的存在，可能会引起不必要的，甚至是未知的不良反应，严重影响治疗结果。

综上所述，传统的细胞冻存液会对牙周膜干细胞产生毒性和免疫原性反应，因此，研发一种不对牙周膜干细胞产生细胞毒性、免疫原性，还能显著提高细胞冻存后复苏活率的冻存液是本领域技术人员亟待解决的技术问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种牙周膜干细胞的冻存液及其冻存方法，能有效解决传统冻存液对牙周膜干细胞产生毒性和免疫原性反应导致的冻存效果差，复苏后细胞活率低的技术缺陷。

本发明提供的一种牙周膜干细胞的冻存液，包括甘油、间充质干细胞无血清培养液和人血白蛋白。