[发明专利]一种精确定量慢病毒包装辅助质粒的方法

权利要求书

1.一种精确定量慢病毒包装辅助质粒的方法，其特征在于：包括对三个辅助质粒分别携带的特殊基因设计特异性引物和慢病毒包装辅助质粒的检测，所述的特殊基因为gag基因、rev基因和vsv-g基因，分别对gag基因、rev基因和vsv-g基因设计一对特异性引物，如下表：

2.根据权利要求1所述的一种精确定量慢病毒包装辅助质粒的方法，其特征在于：所述慢病毒包装辅助质粒的检测的步骤如下：

S1用PCR扩增出各基因的相应片段；

S2将各基因产物分别构建在T载体上，形成新的克隆质粒；

S3分别将克隆质粒转化到大肠杆菌中，鉴定，培养，抽提质粒；

S4根据三个质粒的核酸浓度和重组质粒的分子量，计算出相应的拷贝数，并且以此为标准品；

S5将标准品稀释成一系列浓度梯度，由此可得到一个标准曲线；

S6上机检测待测质粒的具体拷贝数；

S7根据三个包装辅助质粒的具体拷贝数，优化各质粒的比例。

3.根据权利要求2所述的一种精确定量慢病毒包装辅助质粒的方法，其特征在于：所述步骤S1)PCR反应体系为：以三个辅助质粒为模板，分别加入到新的PCR管中；在PCR管中，加入相应的上下游引物各2μl；然后依次加入dNTP 4μl，10×PCR Buffer 5μl，用无菌水加至50μl；最后加入高保真DNA聚合酶0.25μl。

4.根据权利要求2所述的一种精确定量慢病毒包装辅助质粒的方法，其特征在于：所述步骤S1)PCR反应条件为：预变性95℃/2min；变性95℃/20sec，退火60℃/20sec，延伸72℃/20sec，30个循环；补全延伸72℃/10min。

5.根据权利要求2所述的一种精确定量慢病毒包装辅助质粒的方法，其特征在于：所述步骤S2)T载体的连接体系及条件：将PCR产物加入微量离心管中；再加入Vector 1μl，补去离子水至5μl,混匀；加入5μl(等量)的SolutionⅠ,16℃反应30min。

6.根据权利要求2所述的一种精确定量慢病毒包装辅助质粒的方法，其特征在于：所述步骤S3)T载体的转化：全量(10μl)加入至100μl JM109感受态细胞中，冰上放置30min；42℃加热45sec,再在冰中放置1min；加入890μl SOC培养基，37℃震荡培养60min；在含有X-gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落；

重组T载体的鉴定：挑选白色菌落，使用PCR法确定载体中插入片段的长度大小；

重组质粒的抽提：将阳性克隆送交DNA序列分析，选取和保留序列正确的克隆，常规制备DNA质粒。

7.根据权利要求2所述的一种精确定量慢病毒包装辅助质粒的方法，其特征在于：步骤S5)所述的一系列浓度梯度可为10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³和10²。