[发明专利]一种诸葛菜胚状体和植株的培养方法

说明书

技术领域

本发明属于植株培养领域，具体地说，涉及一种诸葛菜胚状体和植株的培养方法。

背景技术

诸葛菜[Orychophragmus violaceus(L.)O.E.Schulz]为十字花科(Cruciferae)诸葛菜属植物，主要分布在中国，在许多地区都有自然分布或人工引种栽培。诸葛菜常被用作园林、城市绿化地被植物和花坛花卉，别称“二月蓝(兰)”。除本身具有较高的观赏价值外，诸葛菜还可能是创造红花观光型油菜品种的基因供体优良材料。将油菜近缘植物芥蓝(Brassica alboglabra)与诸葛菜杂交，杂种即开紫红或粉红花(殷家明等，1998)。另外，诸葛菜还是极具开发前景的蔬菜和饲料种质资源。

诸葛菜在我国分布广，遗传变异大，多样性丰富，这为诸葛菜的选育提供了材料基础。通过花药或花粉培养可以快速获得单倍体和纯合二倍体，有利于诸葛菜新材料的选育和研究。吴沿友等(吴沿友，罗鹏.1996.诸葛菜的花药培养.园艺学报，23(4):404-406.)进行诸葛菜花药培养，得到了少量胚状体和再生植株，而且所得植株为混倍体，且植株的组织来源是花药体细胞还是小孢子并不清楚。贾勇炯等(贾勇炯，唐琳，林宏辉，陈放，王幼平.1999.诸葛菜离体花粉粒诱导形成花粉植株的研究.四川大学学报(自然科学版)，36(6):1106-1110.)从4℃低温处理4天的诸葛菜花药中再分离小孢子进行培养，获得了愈伤组织和再生植株，其植株再生途径为小孢子愈伤组织，再生植株容易发生变异。然而，关于诸葛菜游离小孢子培养获得胚状体和再生植株还未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种诸葛菜胚状体和植株的培养方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种诸葛菜胚状体和植株的培养方法，包括以下步骤：

1)9月中下旬，将诸葛菜种子于大田播种育苗，将幼苗移栽到玻璃温室内土壤中，成活后每窝施复合肥5g，根据需要浇水；温室光照为自然光，温度不做特殊控制；开花后取样进行小孢子培养；

2)小孢子培养：花期上午8～9点，从生长健康植株取4～5mm长花蕾，经5％氨替福民溶液消毒10～15min后用无菌水清洗；消毒花蕾置于培养皿中，加适量B₅-13培养液(pH5.8，含13％蔗糖)，用注射器内筒研磨挤压出花粉，400目不锈钢筛网过滤，将花粉悬液转移到离心管中离心，弃上清液，再加入B₅-13培养液摇匀离心；如此重复离心3次后，用pH6.0的NLN-13培养液按1蕾花粉/mL密度悬浮；将小孢子NLN-13悬液混匀，分装于ф6cm培养皿，在每皿中添加活性炭储存液，封口膜封口后进行热激培养，然后转移到25℃下继续暗培养，肉眼可见胚状体时转入振荡培养箱中进行培养，得到子叶胚；

3)植株再生、移栽：将振荡培养后的子叶胚转移到琼脂培养基上，在光照条件下培养；出芽后将芽切下继代保存和扩繁到每个花粉植株无性系具有3～5芽；移栽前1个月，将芽转移到生根培养基上生根；生根后的试管苗经炼苗1周后移栽到试验地，最初1周内用白色塑料膜遮蔽。

进一步地，步骤2)中的活性炭储存液通过以下步骤制备得到：在100mL超纯水中加入1g活性炭和0.5g琼脂糖，121℃高温灭菌后储存备用。

进一步地，步骤2)中离心条件为：转速为900-1500r/min，时间为1-5min。

进一步地，步骤2)中每皿中活性炭与小孢子NLN-13悬液的质量体积比(mg/mL)为：1:4～3:4。

进一步地，步骤2)中热激培养条件具体为：32～35℃暗培养1-7天。

进一步地，步骤2)中振荡培养箱中的培养条件为：转速为55-65r/min，时间为14～20d，温度为25℃。

进一步地，步骤3)中子叶胚转移到琼脂培养基中的琼脂培养基为：1/2MS+3％蔗糖+7g/L琼脂，pH＝5.8；光照条件为20℃、1000Lux16h/d。

进一步地，步骤3)中生根培养基为：1/2MS+0.5mg/L IBA+3％蔗糖+7g/L琼脂培养基，pH＝5.8。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)活性炭和热激培养对胚状体诱导是必需的。在ф6cm培养皿中培养4mL 1花蕾花粉/mL的小孢子NLN-13悬液时，每皿添加1mg活性炭和32℃热激3天的培养子叶形胚状体和总胚状体产量最高，分别为0.92±0.18个/花蕾和1.32±0.25个/花蕾。