[发明专利]鸭腺病毒A型和2型双重EvaGreen实时荧光定量PCR检测引物

说明书

本发明提供鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型双重EvaGreen实时荧光定量PCR检测引物及试剂盒，所述引物序列如SEQ ID NO.1‑4所示，具有很高的特异性和灵敏度。当前国内外尚未见可基于饱和荧光染料Eva Green可同时对鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型双重实时荧光定量PCR检测方法的引物研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

技术领域

本发明提供鸭腺病毒A型和2型双重EvaGreen实时荧光定量PCR检测引物，属于动物传染病学领域。

背景技术

腺病毒基因组全长约为33 kd，基因组为线性双链DNA；该类病毒颗粒为无囊膜的核衣壳呈二十面体对称，其中腺病毒的核衣壳有3个主要结构蛋白，分别为六邻体蛋白（Hexon）、纤维蛋白 (Fiber)和五邻体蛋白（Penton）。其中，Hexon蛋白是腺病毒科各属病毒最主要的结构蛋白，含有病毒主要的保护性抗原基因簇，与病毒的致病性密切相关。

当前，腺病毒科下设5个属，分别为富AT腺病毒属、禽腺病毒属、鱼腺病毒属、哺乳动物腺病毒属和唾液酸酶病毒属。其中富AT腺病毒属有5个种，分别为牛腺病毒D型、绵羊腺病毒D型、袋鼠腺病毒A型、蛇腺病毒A型和鸭腺病毒A型（简称DAdV-A）。

鸭腺病毒2型（duck adenovirus 2，DAd V-2）是近年来利用病毒宏基因组学发现的一种鸭源新型腺病毒，该病主要发生在20～30日龄鸭中，以肝和脾肿大、出血为主要特征，死亡率约为7％。核苷酸同源性分析比较发现，鸭腺病毒2型（GR株）和鸭腺病毒A型分离株的核苷酸同源性约为50.0%。通过对其基于Hexon蛋白的遗传进化分析发现，所有鸭腺病毒A型分离株在遗传进化上均处于相同的亚分支，且和绵羊腺病毒D型（OAV287株）均处于富AT腺病毒属遗传进化分支。但鸭腺病毒2型（GR株）和禽腺病毒A型Phelps株（鸡源）与P29株（鹅源）处于同一遗传进化分支，均属于禽腺病毒属遗传进化分支。

实时荧光定量PCR方法（Real time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。双重实时荧光定量PCR是一种特殊的荧光定量PCR形式，其突出的特点是一次实时荧光定量PCR反应可同时检测两种病原，对病原复杂或存在多种基因型的病原鉴别检测十分有效。当前，实时荧光定量的在非特异性荧光标记中，荧光染料包括饱和荧光染料和非饱和荧光染料，分别为：不饱和染料（主要是SYBR GreenⅠ）和饱和染料（主要是EvaGreen）有两种常用的荧光染料。前期研究发现，EvaGreen对实时荧光定量PCR的抑制性远小于 SYBR Green I ，故EvaGreen 既可用于多重 PCR ，也可用于高分辨率（高清晰）熔解曲线分析（HRM），该分析正被越来越多的用于实时荧光定量PCR后的基因分型和异源双链分析。此外，EvaGree稳定性极强且因其对细胞膜透性较低，而较SYBR GreenⅠ更加安全。

当前，在鸭群中存在2种腺病毒科但分属于不同腺病毒属的病原：鸭腺病毒A型（属于腺病毒科富AT腺病毒属）和鸭腺病毒2型（属于属于腺病毒科禽腺病毒属）。因此，建立能够同时对鸭群中鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型的检测方法，既可简化操作程序、节约成本，又对鸭群中2种腺病毒科但分属于不同腺病毒属的病原（鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型）的流行病学调查及开展相关病原学致病机理研究均具有重要的意义。但是，当前国内外尚未见基于饱和荧光染料Eva Green可同时对鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型双重实时荧光定量PCR检测方法的引物研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

发明内容

本发明提供鸭腺病毒A型和2型双重EvaGreen实时荧光定量PCR检测引物及试剂盒, 建立能够同时对鸭群中鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型检测的EvaGreen实时荧光定量PCR方法，简化操作程序、节约成本。