[发明专利]支气管原代上皮细胞的培养与鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种支气管原代上皮细胞的培养与鉴定方法。

背景技术

人支气管上皮细胞主要功能：(1)支气管表面的上皮细胞构成了基底柱状结构，清除粘液纤毛。(2)由纤毛、无纤毛和能分泌黏液的细胞等混合细胞群组成物理屏障，可有效防止多种有毒物质。(3)产生和分泌大量化学介质和细胞因子形成高度复杂的宿主防御系统。人支气管上皮细胞与主要病理生理疾病有关，如支气管肺癌(多简称为肺癌)、慢性支气管炎、支气管扩张、支气管狭窄。为了获得体外稳定传代的人正常支气管上皮细胞，使人们可以更全面地研究细胞的正常功能，疾病发病机理，组织器官功能重建或再造，以及测定药物对正常细胞的毒性，研究人员做出了大量的工作。

目前，传统培养方法主要为：原代细胞的分离培养、ALI培养基添加成分、预铺胶原类型的选择、细胞的接种密度等各不相同。

传统培养方法缺陷在于：体外培养支气管原代上皮细胞的存活率非常低。因此，有必要提供一种支气管原代上皮细胞的培养与鉴定方法，提高体外培养支气管原代上皮细胞的存活率。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提供支气管原代上皮细胞的培养与鉴定方法，以提高支气管原代上皮细胞体外培养的成活率。

第一方面，本发明提供了支气管原代上皮细胞的培养方法，包括如下步骤：

S1、用胶原蛋白铺满器皿的表面，包被处理后备用；

S2、经支气管镜，用一次性气管刷取支气管前壁上皮细胞，用一次性吸液管吹吸离心管内毛刷数次后，加入培养基内，点到包被好的培养皿中间培养至细胞铺满整个细胞孔；

S3、用胰蛋白酶－EDTA消化液消化细胞孔，转移到细胞培养瓶细胞培养箱培养，1-2天换液一次，至细胞铺满整个细胞瓶。

本发明中，作为一种优选的技术方案，步骤S1的详细过程为：用无菌0.006-0.008mol/L乙酸将胶原蛋白稀释到0.03-0.05mg/mL，在12孔板内每孔加300-400uL，确保胶原蛋白溶液铺满器皿的表面，开盖在超净台中常温放置1-2小时后，用保护性毛刷洗3-5次后，在超净台中利用风机吹干并用紫外消毒30-40min后使用。

本发明中，作为一种优选的技术方案，所述胶原蛋白为鼠尾胶原蛋白(索莱宝)。

本发明中，作为一种优选的技术方案，步骤S2的详细过程为：经支气管镜，用一次性气管刷取支气管前壁上皮细胞，力道均匀刷3-4次后，用无菌剪刀剪下前端毛刷，放入装有RPMI1640培养液的离心管内(无菌操作)；用一次性吸液管吹吸离心管内毛刷数次后，1000-1200rpm离心10-15分钟，去上清后加入150-170uL BEGM培养基，吸取30-50uL点到包被好的细胞培养皿中央，放到细胞培养箱培养4小时；取出以后加入500-600uL培养基，放细胞培养箱中培养，1-2天换液一次，至细胞铺满整个细胞孔。

本发明中，作为一种优选的技术方案，所述细胞培养箱培养条件为37℃、5％CO₂。

本发明中，作为一种优选的技术方案，步骤S3的详细过程为：用胰蛋白酶－EDTA消化液消化细胞孔5-10min，加入1mL RPMI1640培养液终止消化后，1500-1700rpm离心5-10分钟，去上清后加入1mLBEGM培养基，1600-1800rpm离心5-10分钟，去上清后加入4mLBEGM培养基，转移到25cm²细胞培养瓶，放置细胞培养箱培养，1-2天换液一次，至细胞铺满整个细胞瓶。

本发明中，作为一种优选的技术方案，胰蛋白酶－EDTA消化液的质量分数为0.25％。

第二方面，本发明提供了支气管原代上皮细胞的鉴定方法，包括细胞免疫组化染色鉴定方法。

本发明中，作为一种优选的技术方案，细胞免疫组化染色鉴定方法的具体步骤为：