[发明专利]一种叠氮吲哚二甲川菁染料分子及应用

说明书

本发明公开了一种叠氮吲哚二甲川菁染料分子及应用，本发明的叠氮吲哚二甲川菁染料以吲哚二甲川菁染料为核心骨架，在吲哚的氮原子上引入了含有酯键和叠氮基团的侧链。本发明所述的叠氮吲哚二甲川菁染料具有细胞膜通透性，可用于蛋白质检测，活细胞染色，以及基于细菌内酯酶活性判断细菌的生存状态,选择性抑制死细菌在反应中的扩增,从而达到对活细菌快速定量检测的目的。本发明染料分子在活菌检测方面更具应用前景。

技术领域

本发明涉及生物领域，涉及一种适用于细胞染色、活菌检测的分子的结构及其在细菌检测技术中的应用。

背景技术

WHO报告表明，全球每年发生40～60亿例食源性疾病，其中约70％是因生物源性污染食品所致。目前世界公认的能引起食源性疾病的重要致病菌，如广泛存在于奶制品、蔬菜、水产品、肉制品等中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、大肠杆菌0157、志贺氏菌等，是影响食品安全的重要因素。微生物以多种生理状态存在：可培养的活菌，处于非可培养状态的活菌(Viable but Non-culturable，VBNC)，具有完整结构但无生物活性的死菌(“Ghosts”)以及膜损伤死菌。只有“活菌”才保留有原菌的毒力和致病性，对食品安全造成潜在的威胁，而经过高温、紫外线等各种途径灭活处理的细菌已丧失了其致病性，因此食源性致病菌检验的关键是食品中“活”的致病菌是否存在和准确定量。

目前用于区别活菌和死菌的标准主要有是否可培养，是否有代谢活性以及细胞膜是否完整。分离培养法对于活的非可培养状态的细菌会出现漏检。活菌EMA/PMA-PCR检测技术是近年来迅速兴起的一种高特异性，高灵敏度的核酸检测方法。检测依据是EMA和PMA都没有细胞膜通透性，EMA和PMA只能渗入膜损伤的细胞,与DNA发生共价结合，从而抑制膜损伤细胞中DNA在反应中的扩增。有研究显示，对于一些可逆性的部分膜损伤细胞(如存在于环境样本中的细菌)，染料仍有可能穿透细胞膜，造成不同程度的活菌DNA损失，产生假阴性结果。另外，对于紫外线灭菌法、冷冻灭菌法等不直接作用于细胞膜的灭菌方法，也不能采用基于EMA或PMA的活菌PCR方法来评估灭菌方法的效果，否则会造成活细胞数目的高估。所以，细胞膜损伤可能是细菌死亡的一种极端表现形式，以细胞膜的完整性作为区分活菌和死菌的检测标准仍有缺陷，因此需要提出一种更科学的区分标准。

发明内容

本发明目的是提供一种基于细菌酯酶活性检测活菌数量的叠氮吲哚二甲川菁染料分子(简称IDA)及应用。所述的叠氮吲哚二甲川菁染料分子具有细胞膜通透性，不仅可以进入死细胞内，还可以进入活细胞内，该染料分子进入细胞后，在活细胞中细菌酯酶可以水解染料分子上的酯键从而使叠氮基团脱落，在死细胞中酯酶无活性导致叠氮基团无法脱落而与DNA分子发生交联从而抑制死细胞中DNA的扩增，达到检测活菌的目的。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种叠氮吲哚二甲川菁染料分子，该分子结构包括：结合基团、酶标基团、交联基团以及连接部位四部分。分子结构如下：

上述叠氮吲哚二甲川菁染料分子用于细胞的快速荧光染色以及活菌含量检测。

本发明叠氮吲哚二甲川菁染料分子合成方法简单，原料廉价易得，合成路线如下：

化合物3由化合物1与溴乙酸叔丁酯反应得到；先用四氢呋喃溶解化合物1，然后在0℃下加入NaH后搅拌30min再逐滴加入溴乙酸叔丁酯，用乙酸乙酯萃取后，经过干燥、过滤、蒸发后即可得到化合物3。

化合物6由化合物3与化合物5反应得到；化合物5由乙醇溶解化合物4后加入CH₃I在85℃下搅拌过夜后浓缩、纯化后得到。用乙醇溶解化合物3和化合物5加入一滴哌啶，反应物过夜回流后得到化合物6。

化合物7由化合物6加入浓盐酸过夜搅拌回流，LCMS显示反应完全后，经过过滤、洗涤、干燥后得到。