[发明专利]在细胞内产生点突变的融合蛋白、其制备及用途

权利要求书

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白含有胞嘧啶脱氨酶和核酸酶活性缺失、保留了解旋酶活性的Cas酶，或由胞嘧啶脱氨酶和核酸酶活性缺失、保留了解旋酶活性的Cas酶形成。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，

所述Cas酶的核酸酶活性全部缺失，无DNA双链断裂能力，或部分缺失，仅具有DNA单链断裂能力；和/或

所述Cas酶选自：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、其同源物或其修饰形式；优选地，所述Cas酶为Cas9酶，优选选自：来自化脓链球菌的Cas9、来自金黄色葡萄球菌的Cas9，以及来自嗜热链球菌的Cas9；和/或

所述胞嘧啶脱氨酶为全长胞嘧啶脱氨酶、或其保留了酶活的片段或突变体，其中所述片段至少包括胞嘧啶脱氨酶的NLS结构域、催化结构域和APOBEC样结构域；和/或

所述融合蛋白还包含以下序列中的一种或多种：接头，核定位序列，以及为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化而引入的氨基酸残基或氨基酸序列。

3.如权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，

所述Cas酶为Cas9酶，该酶的两个核酸内切酶催化结构域RuvC1和/或HNH发生突变，导致该酶核酸酶活性缺失、保留了解旋酶活性；优选地，所述Cas9酶的RuvC1和HNH都发生突变，导致该酶核酸酶活性缺失、保留了解旋酶活；更优选地，所述Cas9酶的第10个氨基酸天冬酰胺突变为丙氨酸或其它氨基酸，第841位氨基酸组氨酸突变为丙氨酸或其它氨基酸；更优选地，所述Cas9酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第42－1452所示，或如SEQ ID NO:72第42-1419位氨基酸残基所示；和/或

所述胞嘧啶脱氨酶的片段至少包含胞嘧啶脱氨酶的第9－182位氨基酸残基，例如至少包含第1－182位氨基酸；优选地，所述片段由第1－182位氨基酸残基组成，由第1－186位氨基酸残基组成，或由第1－190位氨基酸残基组成；或者，所述胞嘧啶脱氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第1457－1654位氨基酸所示，所述片段至少包含SEQ ID NO:2的第1465－1638位氨基酸残基，例如至少包含SEQ ID NO:2第1457－1638位氨基酸残基，优选地，所述片段由SEQ ID NO:2第1457－1638位氨基酸残基、SEQ ID NO:2第1457－1642位氨基酸残基，或SEQ ID NO:2第1457－1646位氨基酸残组成；所述突变体在第10、82和156位具有取代突变，优选地，所述取代突变是K10E、T82I和E156G，更优选地，所述突变体含有如SEQ ID NO:68第1447-1629位所示的氨基酸序列，或由如SEQ ID NO:68第1447-1629位所示的氨基酸残基组成。

4.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2、4、66、68、70或72所示，或如SEQ ID NO:2第26－1654位氨基酸所示，或如SEQ ID NO:4第26－1638位所示，或如SEQ ID NO:68第26－1629位氨基酸所示，或如SEQ ID NO:70第26－1629位氨基酸所示，或如SEQ ID NO:72第26－1638位氨基酸所示。

5.一种多核苷酸序列，选自：

(1)编码权利要求1－4中任一项所述的融合蛋白的多核苷酸序列；和

(2)(1)所述序列的互补序列。

6.一种核酸构建物，所述核酸构建物含有权利要求5所述的多核苷酸序列；优选地，所述核酸构建物是表达载体，用于在宿主细胞中表达本文所述的融合蛋白。

7.一种宿主细胞，所述宿主细胞含有或表达权利要求1－4所述的融合蛋白，或含有权利要求5所述的多核苷酸序列或权利要求6所述的核酸构建物。