[发明专利]头孢拉定合成酶突变体及其编码基因

说明书

本发明公开了一种头孢拉定合成酶突变体及其编码基因。本发明提供了如下A)或B)或C)所示蛋白质：A)将大肠杆菌天然青霉素G酰化酶的β链的第24位苯丙氨酸替换为丙氨酸，β链的第67位丝氨酸替换为丙氨酸后得到的；B)将大肠杆菌天然青霉素G酰化酶的α链的第142位甲硫氨酸替换为亮氨酸，β链的第24位苯丙氨酸替换为丙氨酸，β链的第67位丝氨酸替换为丙氨酸后得到的；C)将A)或B)所限定的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有合成头孢拉定能力的由A)或B)衍生的蛋白质。本发明所提供的蛋白质均具较高的合成头孢拉定的活性和V_s/V_h以及较低的α，为酶法合成头孢拉定的工业化奠定了基础。

技术领域

本发明属于生物化学领域，涉及一种头孢拉定合成酶突变体及其编码基因，特别涉及大肠杆菌青霉素G酰化酶组合突变体、编码基因及其在合成头孢拉定中的应用。

背景技术

半合成β-内酰胺类抗生素是医药行业中使用最广泛的抗生素，每年产量达3万吨，年销售额超过150亿美元，占整个抗生素市场的65％，其中头孢菌素类占比约2/3。与此同时，用于合成β-内酰胺类抗生素及β-内酰胺母核的青霉素G酰化酶的用量也高达1000～3000万吨(H,M,Grulich M,et al.Current state and perspectivesof penicillin G acylase-based biocatalyses.Applied Microbiology andBiotechnology,2014,98(7):2867-2879)。头孢拉定是美国施贵宝制药公司于1972年研究成功的第一代半合成头孢类抗生素，1977年首次在日本上市，也称先锋霉素VI，因其临床使用中的具有很多优点在我国占据很大市场。

头孢拉定的合成方法包括化学法和酶法。目前工业生产中多采用化学法，尤其是混合酸酐法来制备头孢拉定。化学法生产头孢拉定的过程中存在着活化、缩合、基团保护与去保护等多个步骤，合成过程繁琐，反应条件苛刻，产生大量三废。酶法合成头孢拉定则工艺简单，反应条件温和，生产周期短，并且绿色环保(芮菊，张体磊.酶法合成7-ACA及头孢菌素类抗生素的研究进展.中国药学会学术年会暨中国药师周.2008:348-348)。酶法合成头孢拉定如图1所示。目前报道的青霉素G酰化酶及其突变体合成头孢拉定的收率不够高，酶法未能工业化。但随着环保要求越来越高，开发高质量的头孢拉定合成酶显得尤为重要和迫切。