[发明专利]一种双泵补料法及基于双泵补料法的重组大肠杆菌发酵方法

说明书

本发明涉及微生物发酵技术领域，特别涉及一种双泵补料法及基于双泵补料法的重组大肠杆菌发酵方法。所述双泵补料法为采用恒速补料泵和溶氧关联泵对发酵液进行补料的方法，首先打开恒速补料泵，将恒速补料泵流加葡萄糖的速度调整至小于发酵液中葡萄糖的消耗速度，再打开溶氧关联泵，设置关联溶氧值；当发酵液的溶氧值高于所述溶氧关联泵的设定值时，溶氧关联泵开启进行补料，当发酵液的溶氧值低于所述溶氧关联泵设定值时，溶氧关联泵关闭。采用本发明的双泵补料法对重组大肠杆菌进行发酵，溶氧波动范围缩小至10％。发酵结束时，发酵液的OD值达到160，发酵液中重组大肠杆菌表达的水解酶酶活达到180U/ml，大大提高了大肠杆菌的发酵水平。

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，特别涉及一种双泵补料法及基于双泵补料法的重组大肠杆菌发酵方法。

背景技术

利用基因重组技术构建的生物工程菌的发酵工艺不同于传统的发酵工艺。就其选用的生物材料而言，前者含有带外源基因的重组载体，而后者是单一的微生物细胞；从发酵工艺考虑，生物工程菌发酵生产的目的是希望能获得大量的外源基因产物，尽可能减少宿主细胞本身蛋白的污染。而外源基因的高水平表达，不仅涉及宿主、载体和克隆基因三者之间的相互关系，而且与其所处的环境条件息息相关，因此仅按传统的发酵工艺生产生物制品是远远不够的，需要对影响外源基因表达的因素进行分析，探索出一套适于外源基因高效表达的发酵工艺。

基因工程菌发酵问题中最重要的两个问题是菌体的高密度发酵和诱导条件的确定。菌株的高密度生长将导致供氧不足和培养基中大量乙酸的产生，这将极大的影响菌体的生长；另外，菌体密度的高低与外源蛋白表达量之间并没有直接相关性，它们之间的结合点就是诱导条件的确定。

重组大肠杆菌在发酵过程中存在葡萄糖流加速率与溶氧控制相关联的问题。如果葡萄糖流加过快，则会导致溶氧水平过低，使发酵处于厌氧状态，目标产物产量降低；如果葡萄糖流加过慢，则会导致溶氧水平过高，菌体处于饥饿状态，自溶现象增加，影响目标产物的产生。目前大肠杆菌发酵的补料方法为单泵补料法，即将溶氧与补料相关联，如果溶氧高于设定值，补料自动开启；溶氧低于设定值，补料自动关闭。该方法在运行过程中存在溶氧波动范围大，上限与下限相差60％的问题，严重影响发酵水平的提高。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种双泵补料法，及利用双泵补料法对重组大肠杆菌进行发酵方法，解决了大肠杆菌发酵过程中溶氧波动范围大，发酵水平低的技术问题。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种双泵补料法，所述双泵补料法为采用恒速补料泵和溶氧关联泵对发酵液进行补料的方法，首先打开恒速补料泵，将恒速补料泵流加葡萄糖的速度调整至小于发酵液中葡萄糖的消耗速度，再打开溶氧关联泵，设置关联溶氧值；当发酵液的溶氧值高于所述溶氧关联泵的设定值时，溶氧关联泵开启进行补料，当发酵液的溶氧值低于所述溶氧关联泵设定值时，溶氧关联泵关闭。

其中，所述双泵补料法用于重组大肠杆菌发酵液加入诱导剂之后的发酵过程中。

本发明还提供了一种基于所述双泵补料法的重组大肠杆菌发酵方法，包括以下步骤：

(1)将重组大肠杆菌种子液接种至含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵；

(2)发酵过程中控制发酵液的溶氧、pH及补料，使发酵液的OD值增长；

(3)当发酵液的OD₆₀₀值增长至38～42时，加入诱导剂进行低温诱导，采用上述双泵补料法继续进行发酵，当发酵液的OD₆₀₀停止增长时，结束发酵。

其中，所述步骤(2)的具体步骤为：通过调节发酵罐的搅拌转速和空气流量将发酵液的溶氧控制在50％以上；当发酵液的pH开始下降时，用氨水调节发酵液的pH在6.5～7.5；当发酵液的溶氧上升时，将补料与溶氧关联，设定溶氧关联值为20％，补加葡萄糖进行发酵。