[发明专利]一种人类冻存单个核细胞高效扩增NK细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，具体地说，涉及一种人类冻存单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)高效扩增自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)的方法。

背景技术

自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)，是机体内天然免疫第一道防线。它具有高效抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节功能，在防御机体疾病中发挥着重要作用。自然杀伤细胞具有不受组织兼容性抗原限制，即杀伤活性无MHC限制。细胞具有广谱杀毒性，且不需要抗原递呈细胞启动即可直接进攻癌细胞。自然杀伤细胞通过直接溶解、释放穿孔素和分泌细胞因子两个方面进行杀瘤。细胞可以分泌TNF-ɑ、IFN-γ和IL-1细胞因子。这些细胞因子在调节淋巴细胞发挥免疫功能起着重要作用。科学研究表明，自然杀伤细胞具有调节免疫功能和神经系统相互作用能力。理论上这种细胞可以成为高效治疗癌症免疫疗法。然而，自然杀伤细胞在外周血中含量仅为5％-10％，随着年龄增长，免疫器官衰老，细胞活性和数量随之降低。免疫功能降低，直接或间接导致疾病和恶性肿瘤发生。

过继免疫细胞疗法是抽取癌症患者外周血，在体外增殖免疫细胞并回输到体内。在此状态下制备免疫细胞具有较小杀瘤能力，临床上不能达到满意疗效，因此，研究中找到高活性免疫细胞，并建立质量稳定、足够数量、高纯度和杀瘤活性强培养方法成为亟待解决问题。

通过对不同年龄段人群分析发现，随着年龄增高，免疫力逐渐下降。当年龄25岁时，细胞活力和数量达到最大值。当年龄25-55之间时，细胞活力和数量处于最优，当年龄超过55岁时，细胞活性和数量呈现下降趋势。为了提供健康保障，我们在年轻健康时将免疫细胞即外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)存储下来，未来待需要时通过免疫治疗方法，可以及时为我们补充健康免疫细胞，抗衰保健，提高免疫力，预防疾病发生和肿瘤免疫治疗。因此，体外建立冻存PBMC高效增殖自然杀伤细胞培养方法是细胞过继免疫治疗肿瘤关键。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种人类冻存单个核细胞高效扩增NK细胞的方法。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种人类冻存单个核细胞高效扩增NK细胞的方法，包括如下步骤：

(1)将冻存的单个核细胞融化，将融化后细胞悬液迅速转移到NK-EX培养液中，离心，弃上清，将沉淀细胞打散，将细胞接种至包被CD₃/CD₂₈T细胞激活剂的培养瓶中，加入刺激液和AB血浆于培养瓶中，使培养体系中的细胞密度达到(1～1.5)×10⁶个/mL、AB血浆的体积浓度达到5％，记为D₀天；

(2)D₃天解除刺激，将培养瓶中的细胞悬液离心，弃上清，将沉淀细胞打散，将细胞接种至新的培养瓶中，加入扩增培养基和AB血浆于培养瓶中，使培养体系中的细胞密度达到(1～1.5)×10⁶个/mL、AB血浆的体积浓度达到10％；

(3)在D₅天和D₇天向培养的细胞悬液中补加扩增培养基和AB血浆，使体系中的细胞密度维持在(1～1.5)×10⁶个/mL、AB血浆的体积浓度维持在15％；

(4)在D₉天向培养的细胞悬液中补加扩增培养基和AB血浆，使体系中的细胞密度维持在(1～1.5)×10⁶个/mL、AB血浆的体积浓度维持在10％；

(5)在D₁₁天及之后的每隔一天，向培养的细胞悬液中补加扩增培养基和AB血浆，使体系中的细胞密度维持在(1～1.5)×10⁶个/mL、AB血浆的体积浓度维持在2～3％；

(6)在D₁₄天后对细胞悬液进行采样细胞计数，当连续两天计数结果变化不大于10％时，可以进行细胞收集。

期间，可依据补液量选择更换更大规格的细胞培养瓶或细胞培养带，可选地，例如T175细胞培养瓶或1000mL细胞培养袋。