[发明专利]一组用于脑膜炎败血伊丽莎白菌PCR检测的引物组合

说明书

本发明公开了一组引物序列组合以及将其用于PCR扩增的方法，所述方法以脑膜炎败血伊丽莎白菌基因组中的特异性片段EMA为扩增目标，所述方法显示了优异的特异性和敏感性，对在细菌鉴定中容易与脑膜炎败血伊丽莎白菌混淆的脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌、李斯特菌、肺炎支原体、百日咳鲍特菌、肺炎克雷伯菌及结核分支杆菌等易引起脑膜炎及上呼吸道症状的常见病原菌均能够一次性区别开来，而且检测下限可达10^‑4ng/μL。

技术领域

本发明公开了一组用于PCR的引物组合，属于微生物和分子生物学技术领域。

背景技术

脑膜炎败血伊丽莎白菌1959年由Elizabeth O.King分离自新生儿脑膜炎患者，命名为Flavobacterium meningosepticum，1994年，被分类至Chryseobacterium属，命名为Chryseobacterium meningosepticum，2005年，经16S rRNA聚类分析，被分出新的属：Elizabethkingia属，命名为Elizabethkingia meningoseptica。脑膜炎败血伊丽莎白菌在早产儿及婴幼儿中可引起新生儿脑膜炎暴发。

脑膜炎败血伊丽莎白菌为革兰阴性杆菌，广泛分布于自然环境(例如淡水、咸水及土壤)。自1959年发现脑膜炎败血伊丽莎白菌可引起新生儿脑膜炎以来，由该菌引起的相关暴发及临床病例时有报道。1997年，Karen C.Bloch等报道，自1991年12月至1994年9月期间，自免疫功能不全的成人中确认6例脑膜炎败血伊丽莎白菌感染病例，并且分析了之前的相关文献，显示出脑膜炎败血伊丽莎白菌感染与早产儿、低体重儿等因素的相关性。2011年，Issack等统计了2002年8月至2003年12月毛里求斯发生的脑膜炎暴发流行，8例6～20天的婴儿从脑脊液分离到脑膜炎败血伊丽莎白菌，其中7例体重低于2.5千克，菌株表现相同的耐药情况，1例确诊后死亡；治疗3周后，2例发展为脑积水，其中1例死亡，1例有较严重脑损伤；同时国内外多家医院的耐药监测均显示了脑膜炎败血黄杆菌(曾用名)/脑膜炎败血伊丽莎白菌在临床及环境分离株中占有较高的比例，同时多重耐药情况也非常普遍。

尽管脑膜炎败血伊丽莎白菌具有重要的临床意义，其临床检测方法的研究却存在较多问题：

1、基于脑膜炎败血伊丽莎白菌过氧化氢酶阳性、氧化酶阳性、吲哚试验阳性、OF葡萄糖ox+/F-，尿素酶阴性(米尔考拉金氏杆菌阳性)、甘露醇阳性、不能还原硝酸盐(部分非典型菌株可还原硝酸盐)、明胶酶、七叶苷、ONPG及DNA酶阳性，金黄杆菌一般吲哚试验阳性，但是其他生化多为非发酵或反应较弱的生化特征，可以利用现有的例如ID32GN、VITEK2、sensitire(先德)及BD Phoenix等全自动生化鉴定系统进行鉴定，此种鉴定方法的前提是具有分离纯化的菌株，因此对于未能分离培养出疑似病原的临床标本无法进行检测。同时在既往研究中显示，各种生化鉴定系统也存在一定的误判几率，该菌易与杀鲑气单胞菌(ID32GN)、鞘氨醇杆菌属(Vitek 2)混淆。

2、基于16s rRNA测序及序列比对技术：16s rRNA是脑膜炎败血伊丽莎白菌较为常见的检测手段，通过通用引物扩增测序后，可以通过16s rRNA全部/部分基因序列分析完成菌株的鉴别及分析。2005年，将脑膜炎败血黄杆菌从黄杆菌属分离出来重新定义为脑膜炎败血伊丽莎白菌，确定伊丽莎白菌属就是基于此种分析。然而此种技术虽然摆脱了必须培养得到纯菌的前提(尽管如此，大多数基于此种技术完成的临床样品检测工作仍然以分离培养得到纯菌为前提)，但是此种鉴定技术基于测序技术为基础，同时需进行相关序列比对工作，不适宜临床即时获取检验结果的需求。