[发明专利]强脉冲光促进衰老成纤维细胞分泌细胞外基质的方法

权利要求书

1.一种强脉冲光促进衰老成纤维细胞分泌细胞外基质的方法，该方法包括用强脉冲光对衰老成纤维细胞进行辐照，

其中所述成纤维细胞通过如下方法得到：

(1)将皮肤组织切除皮下脂肪组织，然后切取1cm×0.3cm大小的一块，置于含青霉素和链霉素各100u/ml的DMEM培养基中浸泡15min；

(2)用PBS缓冲液反复冲洗后，剪切成1～2mm的小块，然后加入0.25wt.％胰蛋白酶，于37℃条件下继续消化5～8小时；

(3)在消化的同时进行振荡，随时在显微镜下观察消化结果，当成纤维细胞大部分从包裹的细胞外基质纤维中分离出来时，用含10％小牛血清的DMEM培养基终止消化；

(4)用100目不锈钢网过滤，去除大的组织块残渣，将滤液慢速离心，取上清液，将上清液以1000rpm离心3～6min，弃上清，加PBS5ml，重悬后以1000rpm再离心5～8min，弃上清，然后加入含20wt.％小牛血清的DMEM培养基重悬，细胞计数后以2.5～3×10⁵细胞/50ml一次性培养瓶接种；

(5)然后每隔3天换一次培养液，待细胞融合后，用胰酶消化后传代，体外培养3～6代细胞，即得所需的衰老成纤维细胞；

在用强脉冲光对衰老成纤维细胞进行辐照之前，用分泌促进剂将成纤维细胞进行预处理，该预处理包括以下步骤：向上述方法获得的成纤维细胞加入含10％小牛血清的EMDM培养基，所述培养基预先加入有基于该培养基重量计0.01-1.0wt.％的分泌促进剂；

所述分泌促进剂为下式(I)所示的化合物：

其中R为-CH₃或-OH。

2.根据权利要求1所述的方法，所述强脉冲光的波长为600-1000nm。

3.根据权利要求1或2所述的方法，所述强脉冲光为连续波长的强脉冲光。

4.根据权利要求3所述的方法，所述强脉冲光辐照是在21ms内连续从10J/cm²、15J/cm²、20J/cm²、25J/cm²、30J/cm²、35J/cm²变换到40J/cm²，每种照射能量下平均分配时间，不断循环，共辐照10min-2h。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中在分泌促进剂存在下用强脉冲光对衰老成纤维细胞进行辐照。