[发明专利]疫苗中蔗糖含量的检测方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种疫苗中蔗糖含量的检测方法及其应用，属于生物学检测领域。

背景技术

一、冻干疫苗中冻干保护剂的作用

疫苗由于其特有的理化性质，对生产运输储藏条件都较为苛刻，冻干粉末疫苗由于其性质稳定易于保存，复性快效果好等特点，已逐渐代替针剂型液体疫苗，成为主流疫苗采用的剂型方式。在疫苗冻干的过程中，蛋白质分子在低温环境下极易引起变性，冷冻变性机理是冷冻过程中结晶引起水的状态和结构的变化，是蛋白质变性的主要原因，并且蛋白质变性的程度依赖于冷冻的程度，冷冻温度越低，蛋白质变性越剧烈。在低温下有序的水的结构引起蛋白质分子中疏水键的破坏是导致蛋白质变性的主要原因。蛋白质分子周围分布着多层水分子，在降温过程中，蛋白质分子周围的水分子不断冻结，但只要蛋白质分子表面的单层水分子没有冻结，蛋白质就不会变性，反之亦然。干燥变性机理是干燥过程的变性，主要是发生在二次干燥阶段即移去结合水的阶段。蛋白质在水溶液中是水化的，表面有一层水分子包围，构成一个单层分子，这就是水化层。这层水分子通过氢键和蛋白质相互作用连接。干燥过程要移去一部分水化层的水，破坏蛋白质表面的氢键结构，引起天然结构的变性。

针对上述问题，保护剂成为了冻干疫苗中不可或缺的组成部分。保护剂的作用主要有：1、具有保护病毒及细菌活力、抗原稳定性、耐干燥和冷冻的低分子物质和形成冻干疫苗耐热性结构的有机高分子物质；2、具有高度抗氧化作用的抗氧化剂，能够最大限度地消耗溶液中溶解的氧，减少病毒或细菌与氧的接触，降低病毒或细菌的代谢活力和能量损耗，防止其在冷冻干燥及储运过程中死亡；3、根据保护剂中的每一种物质的共融点进行大量反复冻干试验，科学地确定每一种疫苗的冻干曲线，使病毒或细菌在冻干过程中的失活率降到最低，也使得疫苗形成良好的物理性状。

二、冻干疫苗中冻干保护剂的选择和检测方法

疫苗保护剂一般选择糖类，糖类性质稳定易于结合，不会因为剧烈的温度变化而产生结构上的变化，很适合作为疫苗的冻干骨架使用，蔗糖、乳糖、果糖等糖类均可作为冻干保护剂使用。但冻干疫苗中成分复杂，保护剂的成分及含量很有可能对疫苗本身的效价有影响，因此，选择糖类为该疫苗制备工艺中的冻干保护剂，控制原液中糖类的含量对于研究疫苗的质量、效价和稳定性有重要的意义。以蔗糖为例，目前研究冻干疫苗原液中蔗糖含量的方法主要有3种：比旋度法，高效液相色谱-示差折光检测法和离子色谱-积分脉冲安培检测法。

比旋度法通过测定溶液中的比旋度来确定蔗糖含量，这种测定方法受制备溶液的影响较大，度数精度较低，比旋度法对轮状病毒冻干疫苗原液中蔗糖的专属性差。高效液相色谱法测量冻干疫苗原液中蔗糖含量时，一般需要先使用磺基水杨酸沉淀离心去除蛋白质，再采用氨基柱分离，示差折光检测器测定蔗糖含量，高效液相色谱法操作简便，可大大降低人为因素和环境因素带来的系统误差，检测安全高效，现已大规模用于蔗糖的常规定量检测，但高效液相色谱法中采用的氨基柱寿命短，导致蔗糖的检测成本较高。离子色谱-积分脉冲安培检测时，蔗糖会在强碱性的淋洗液中呈弱酸性，会部分或全部以阴离子形式存在，因此可在阴离子交换柱上被保留并得到分离，利用积分安培检测器，可在色谱工作站中对蔗糖含量进行确定，检测快速准确，灵敏度高。但是其色谱柱价格昂贵，且离子色谱仪非生物制品行业常用仪器。

由于上述检测方法均存在各种各样的问题，并且蔗糖为非还原糖(不能衍生化)，无生色基团也不带电荷，检测难度较大，因此对于蔗糖含量的测定，急需开发出一种快速高效经济的检测方法。

发明内容

冻干疫苗在进行冻干步骤之前为疫苗原液，对疫苗原液的蔗糖含量检测，对该疫苗是否可以进行冻干步骤是十分必要的。针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种疫苗中蔗糖含量的检测方法及其应用。

为实现上述发明目的，本发明采用的疫苗中蔗糖含量的检测方法的技术方案如下：将待测疫苗中离子化后的蔗糖经毛细管电泳分离，毛细管电泳中的背景电解质溶液为含有2,6-吡啶二羧酸的碱性背景电解质溶液，通过检测背景电解质溶液的紫外吸收，间接确定蔗糖的含量。