[发明专利]单色多重定量PCR

说明书

本文公开了用于用单一检测标记在单个反应孔中测定相比于第二靶核酸拷贝数的第一靶核酸拷贝数的方法和组合物。例如，本文公开了用于用单一检测标记在单个反应孔中通过单色多重定量PCR(MMQPCR)测定相比于第二靶核酸拷贝数的第一靶核酸拷贝数的方法和组合物。

本申请为分案申请，其原申请的申请日为2009年12月22日，申请号为200980157269.8，名称为“单色多重定量PCR”。

相关专利申请的交叉引用

本申请要求于2008年12月22日提交的第61/139,890号美国临时申请的优先权，其全文以引用方式并入本文。

关于联邦政府资助的研究的声明

本文公开的部分研究和发明是由美国政府支持在第5R21AG030034号美国国家卫生研究院基金的资助下完成的。美国政府具有本发明的某些权利。

技术领域

本发明公开的内容涉及在使用单一检测标记的单个反应中测定与第二靶核酸序列相比的第一靶核酸序列的相对拷贝数和绝对拷贝数的方法以及可用于实施所述方法的试剂盒。

背景技术

实时定量聚合酶链式反应(QPCR)测定每个反应孔的C_t值，即反应孔的增强的荧光(与产物形成成比例)穿过设定阈值的部分循环数，所述设定阈值是基线荧光之上的几个标准差(Higuchi，R.，Fockler，C.，Dollinger，G.and Watson，R.(1993)Kinetic PCRanalysis：real-time monitoring of DNA amplification reactions.Biotechnology(NY)，11，1026-1030)。C_t值对输入靶DNA的量的对数作图是线性的，使得可通过与在同一板上扩增参照DNA样本的系列稀释物得到的标准曲线比较得到未知物的相对定量。

对于许多QPCR应用，研究者希望将来自靶序列的信号(T)标准化为来自参照序列的信号(R)。早期研究用在嵌入任何双链DNA中时会发荧光的染料例如溴化乙锭或SYBRGreen I测量不同(单重)反应中的T和R，并且这种方法仍在使用。最近的研究已经使用针对每种被定量的DNA序列的具有不同的激发/发射光谱的不同荧光染料，在多色多重QPCR中测量了同一个反应容器中的T和R(Wittwer，C.T.，Herrmann，M.G.，Gundry，C.N.和Elenitoba-Johnson，K.S.(2001)Real-time multiplex PCR assays.Methods，25，430-442)。通过多重QPCR测量T/R比值使必须进行的不同PCR反应的数量减少一半。而且，由于T和R信号两者均是在每个反应管中收集的，对重复反应吸取的给定DNA样本的量的变化不再会产生T/R比值的变化，而在单重QPCR中在不同反应孔中测量T和R时会产生所述变化。

多色多重QPCR的主要缺点在于荧光探针成本较高，以及配备来读取两种或更多种荧光颜色的专用QPCR机器成本高。在多重PCR的传统方法中(不论该PCR是否是定量的)，确定以下引物组和引物浓度有时也过度耗时，所述引物组和引物浓度会防止由一个引物对引起的高拷贝数模板的早期扩增抑制由第二个引物对引起的不同的低拷贝数模板的晚期扩增。

发明内容

本发明提供在使用单一检测标记的单个反应中测定两个或更多个靶核酸序列的拷贝数的方法。还公开了测定端粒序列的拷贝数的方法。这些数据可用于将已测量的端粒长度和对应于在某个群体中观察到的端粒长度的死亡风险或疾病发生可能性相结合。

本文公开了通过使用单一检测标记的在单个反应孔、均一体系中的单色多重定量PCR(MMQPCR)测定相比于第二靶核酸拷贝数的第一靶核酸拷贝数的方法和组合物。