[发明专利]一种3D表皮模型的构建方法

说明书

本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种3D表皮模型的构建方法。该方法用丝裂霉素C（Mitomycin C，MC）处理的成纤维细胞作为滋养层，在其上接种角质形成细胞，利用成纤维细胞分泌的各种因子和蛋白等供给角质形成细胞生长需要，同时配合低浓度血清及EGF、胰岛素及CaCl₂，经液下及气液面两个阶段的培养，构建形成3D表皮模型。本发明所构建的3D表皮模型与人体表皮结构高度一致，且降低了生产成本，满足规模化生产3D表皮模型所需的经济、有效且高效的要求。

技术领域

本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种3D表皮模型的构建方法。

背景技术

传统的化妆品原料筛选及产品开发验证主要通过动物实验来完成，由于种属差异及个体差异导致动物实验的结果无法准确评估其安全性和功效性，且结果重现性差。动物福利保护组织对于抵制动物实验的呼声也越来越高。鉴于上述原因，欧盟、美国及其他国家已相继立法禁止经动物实验的化妆品或原料在其市场销售，为了满足化妆品开发需求，有效评估其安全性和功效性，推动化妆品产业升级，动物替代检测应运而生，而与人体皮肤结构高度一致的皮肤模型成为替代检测方法中的核心工具，表皮模型作为其中一种更是有着举足轻重的地位，因此开发一种符合检测要求，且经济实惠的表皮模型意义重大。

构建表皮模型所用的角质形成细胞是表皮细胞中的主要细胞，它可以形成表皮模型特有基本结构，即基底层、棘层、颗粒层和角质层。一般的角质形成细胞培养多选用无血清培养体系，通过给基础培养液中添加各种外源性的因子，保证角质形成细胞状态稳定、延缓老化发生。但无血清培养液中的添加因子多数都比较昂贵如牛脑垂体提取物（BovinePituitary Extract，BPE），严重影响角质形成细胞及拓展产品的规模化的生产，该细胞在传统的含血清培养体系中又极易发生老化问题而导致模型构建失败，如何解决表皮细胞在含血清培养体系中的增殖、分化问题成为技术的关键。

由于角质形成细胞具有干细胞特性，因此利用滋养层细胞为突破该技术难题提供了可能。滋养层细胞是干细胞筛选、培养及诱导型多功能干细胞（iPSCs）培养常用的一种技术，原代或初期培养阶段一般都需依赖于能分泌他们在体外存活增殖所必需的生长因子的饲养层细胞。不同类型的饲养层细胞分泌的生长因子略有不同，但都要求培养过程中的滋养层细胞不分裂不增殖而仍保持代谢活性。常见的可作为滋养层的细胞有成纤维细胞、3T3细胞、间充质细胞等，常用的有丝分裂阻断剂为丝裂霉素C（Mitomycin C，MC），它与DNA链形成交联，抑制DNA复制，对RNA也有抑制作用，从而达到上述目的。

CN104459145A公开了一种化妆品检测，通过给市售的聚碳酸脂膜上包被IV型胶原，然后通过无血清培养液（Epilife）构建表皮模型，首先按照发明公示内容，仅在培养液中添加脂质混合物和Ca2+即可构建成功表皮模型缺乏理论支持。其次培养液中的脂质添加物价格昂贵，且因为大部分为非水溶物质处理过程中不可避免需引入助溶试剂如二甲基亚峰（DMSO），过量引入或长期残留在培养液中会对细胞的生长带来不可预测的影响。

中国专利201310425798.X公开了一种组织工程表皮模型的构建方法，首先对桑蚕丝进行脱胶、溶解、透析和浓缩制备丝素蛋白溶液，然后用制备的丝素蛋白溶液浸润热塑性无纺布，后经过真空干燥及乙醇处理，制备成接种支撑物，然后上面接种人表皮细胞株HaCat构建成表皮模型。整个支撑物处理过程繁琐、复杂，且引入非皮肤结构的热塑性无纺布，不管是对构建培养中的液体营养传递，还是对后期检测后的组织学切片及结果分析都会产生极大的影响。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种3D表皮模型的构建方法。该方法用丝裂霉素C处理的成纤维细胞作为滋养层，利用成纤维细胞分泌的各种因子和蛋白等供给角质形成细胞生长需要，同时配合低浓度血清及EGF、胰岛素及CaCl2，可以最大限度满足角质形成细胞的生长和分化需求，降低3D表皮模型的生产成本。