[发明专利]构建重组皮肤模型的黑素与角质形成细胞气液面培养基

说明书

技术领域

本发明涉及组织工程技术领域，尤其涉及构建重组皮肤模型的黑素与角质形成细胞气液面培养基。

背景技术

人类皮肤颜色的形成主要是黑素细胞产生并分泌的黑素小体到达角质形成细胞，并在角质形成细胞中重新分布。建立人表皮黑素细胞与角质形成细胞共培养模型可以为研究皮肤色素发生发展机制提供研究平台。生理情况下，黑素细胞可以通过树突与周围角质形成细胞发生接触和联系，角质形成细胞通过直接的细胞间连接控制黑素细胞的生长、形态、树突形成和抗原表达。

黑素细胞与角质形成细胞直接接触共培养分为单层细胞共培养和重建三位表皮结构的共培养，前者比较简便，能为研究黑素细胞和角质形成细胞提供较理想的体外模型，因而被大多数学者所采用，但这种模型并不能形成类似于皮肤的细胞复层化结构，与皮肤正常生理结构存在一定的差距。后者能够准确的模拟表皮黑素单元，为体外研究黑素细胞与角质形成细胞相互作用，色素的转移与分布提供了良好的模型基础。

目前含黑素重组人工皮肤存在的问题是黑素生发不均匀，导致黑素模型表面有点状黑素聚集或半月形黑素聚集，与正常人皮肤状态不一致，形成类似于斑状皮肤，这对于黑素模型的美白功效评价形成阻力。

CN201019018002.2含色素的人工皮肤检测模型及其制备方法中使用的黑素细胞和角质形成细胞共培养的培养基中添加了具有还原性的维生素C，对黑素的生发有抑制作用，不利于后期美白功效评价，且其培养的含色素人工皮肤模型存活时间较短，只有6到11天，不利于长效美白产品的功效评价。

发明内容

本发明提供了构建重组皮肤模型的黑素与角质形成细胞气液面培养基，通过聚集的不正常生发的黑素模型组织切片发现，主要是因为黑素生发不均匀，局部角质形成细胞生发过量导致的，本专利培养基具有促进黑素细胞均匀生发抑制角质形成细胞过量生发的特点，霍乱毒素和TPA的添加促进黑素细胞贴壁和增殖并且抑制角质形成细胞贴壁和增殖。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种构建重组皮肤模型的黑素与角质形成细胞气液面培养基，构建重组皮肤模型的黑素与角质形成细胞气液面培养基以500ml计包括：

角质无血清培养基K-SFM 500ml，胰岛素 2～30μg，氢化可的松 10～800μg，牛脑垂体提取物 10～200mg，上表皮生长因子 20～2000μg，碱性成纤维生长因子 1～1500μg，角质细胞生长因子 5～80μg，12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯TPA 20～200ng，CaCl₂ 10～200mg，霍乱毒素 20～200nM。

进一步地，角质无血清培养基K-SFM 500ml，胰岛素 3～10μg，氢化可的松 100～300μg，牛脑垂体提取物 20～80mg，上表皮生长因子 200～600μg，碱性成纤维生长因子 5～17μg，角质细胞生长因子 6～20μg，12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯TPA 30～100ng，CaCl₂ 20～100mg，霍乱毒素 20～50nM。

进一步地，角质无血清培养基K-SFM 500ml，胰岛素 5μg，氢化可的松 250μg，牛脑垂体提取物 35mg，上表皮生长因子 500μg，碱性成纤维生长因子 1.25μg，角质细胞生长因子7μg，12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯TPA 50ng，CaCl₂ 在气液面培养的第一天添加27.5mg，气液面培养的第二天添加55mg，气液面培养的第三天及以后添加82.5m，霍乱毒素 25nM。

由于该培养基不含血清，排除血清中众多不明细胞因子，如抗原、抗体、激素等干扰，可提高某些药物或因子对表皮细胞影响研究的准确度和精确性，为体外美白测试准确性提供基础。该培养基不含维生素C，对于后期在黑素模型上进行美白评价提高准确性具有重要意义，该培养基可使2种细胞均迅速增殖，黑素细胞树突多为3～5个，黑色素细胞在皮肤基底层内散在分布，细胞突起伸入到角质形成细胞之间，银染染色显示黑色素细胞内及重组皮肤切面有大量色素颗粒存在，黑色素细胞增殖状态良好，该培养基可保持2种细胞构建形成的重组皮肤模型较长时间的存活率，可使重组皮肤模型存活时间达到13-18天，有利于较长时间的美白功效评价。

附图说明

图1为本发明实施例提供的对实施例构建的体外重组人体皮肤表皮黑色素模型，采用苏木精-伊红染色，透射电镜和免疫组织化学分析法检测体外重组人体皮肤表皮模型的结构分层；