[发明专利]一种牙龈上皮模型及其体外构建方法

权利要求书

1.一种牙龈上皮模型及其体外构建方法，其特征是：包括以下方法步骤；

步骤一、牙龈上皮细胞的原代培养及扩增

将正常人牙龈组织经处理获得单细胞悬液，加入角化细胞无血清培养基重新悬浮细胞，转至培养瓶中；然后使用P4~P20代细胞，培养液Ⅰ中培养，然后以胰酶消化制成单细胞悬液，置于37℃、5%CO₂条件下培养进行扩增；

步骤二、牙龈上皮细胞液下接种培养

使用步骤一中扩增后的P4~P20代细胞，以培养液Ⅱ制成单细胞悬液，进行接种后培养1-5小时后再转入液下培养；

步骤三、牙龈上皮模型气液面的增殖分化培养

将上述液下培养中的培养液弃掉，更换为培养液Ⅲ，进行气液面培养，再更换为培养液Ⅳ，继续进行气液面培养，最后更换为培养液Ⅴ，继续进行气液面培养，培养结束，牙龈上皮模型的体外构建结束。

2.根据权利要求1所述的一种牙龈上皮模型及其体外构建方法，其特征是：所述培养液Ⅰ，为DMEM，其所含葡萄糖含量为1.0～4.5g/L，谷氨酰胺含量为1.0～10.0mM。

3.根据权利要求1所述的一种牙龈上皮模型及其体外构建方法，其特征是：所述培养液Ⅱ，为在培养液Ⅰ中，添加人表皮生长因子浓度为0.1～150.0 ng/mL，胰岛素浓度为0.1～150.0 ng/mL，氢化可的松浓度为0.1～20.0μg/mL，三磷酸腺苷浓度为1.0～150.0μg/mL，转铁蛋白浓度为1.0～150.0 ng/mL，孕酮浓度为1.0～100.0 nM，对羟基苯甲酸丁酯浓度为0.1～10.0μg/mL，牛脑垂体浸提物浓度为1.0～100.0μg/mL，腺嘌呤10～100μg/mL，硒酸钠1.0～50.0 nM。

4.根据权利要求1所述的一种牙龈上皮模型及其体外构建方法，其特征是：所述培养液Ⅲ，为在培养液Ⅱ中，添加CaCl₂浓度为20.0～100.0μg/mL，维生素C浓度为10.0～50.0μg/mL。

5.根据权利要求1所述的一种牙龈上皮模型及其体外构建方法，其特征是：所述培养液Ⅳ，为在培养液Ⅱ中，添加CaCl₂浓度为50.0～150.0μg/mL，维生素C浓度为50.0～100.0μg/mL。

6.根据权利要求1所述的一种牙龈上皮模型及其体外构建方法，其特征是：所述培养液Ⅴ，为在培养液Ⅱ中，添加CaCl₂浓度为150.0～300.0μg/mL，维生素C浓度为1.0～10.0μg/mL。