[发明专利]一种无血清的上皮细胞培养液

说明书

本发明实施例提供一种无血清的上皮细胞培养液，涉及生物医学领域，包括基础培养液、必需添加因子、生长因子、贴壁因子、激素、细胞增殖分化的调节因子以及细胞凋亡抑制剂。通过添加P53抑制剂、天然提取的抗氧化剂白藜芦醇和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）协同抑制细胞凋亡的作用，达到抑制细胞培养过程中出现的细胞凋亡，同时添加细胞增殖分化的调节因子，从而避免细胞过早衰老，适用于大规模的细胞扩增培养。

技术领域

本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种无血清的上皮细胞培养液。

背景技术

化学物直接接触或者暴露于眼部，会引发刺激性以及局部毒性。因此，眼表刺激性风险评估是危害评价以及风险规避程序中非常需要的一项。传统方法中对新型化合物的眼刺激潜在风险的评估主要依赖于体外的兔子实验，这种方法耗时耗力、且成本较高。因此，寻找快速、经济的化合物筛选方法成为该领域的一项迫切需求，并激发了大量的关于眼表刺激性风险评估的体外替代方法的建立，例如牛角膜不透明度及渗透性检测，鸡胚尿囊膜实验等，上述技术通过一定程度的组合可以实现体外眼刺激性评价，但却都无法完全实现兔眼刺激实验的体外替代；另外，这些体外替代方法适用范围有限，只能评价化妆品原料，不能评价化妆品成品。近年来，随着体外器官培养技术的发展，基于体外细胞培养构建的3D重组角膜上皮模型，在眼刺激风险评价领域表现出特有的优势，类似于人体角膜上皮的细胞三维结构，不仅可以更为真实的反映人体对化学物的响应，准确给出化学物刺激性的预测，对于化合物筛选的种类也具有更宽的应用范畴，不仅适用于化妆品原料的危害评价，还可以用于不同剂型的化妆品成品的危害评估。

目前，角膜上皮细胞是构建体外三维角膜上皮组织模型最理想的种子细胞，构建的三维角膜模型的生物学特性更能反映真实的角膜组织。然而由于分化后的角膜上皮细胞体外生长的生命周期很短，只能传2～3代，获得的细胞数量少，花费较高，限制了角膜组织的研究和组织工程化角膜的构建。如何改进体外培养技术，培养出分裂增殖能力强、能不断分裂生长的角膜上皮细胞，以补充细胞的不断更新，成为获得角膜上皮种子细胞的首要任务。另外，研究发现口腔黏膜上皮细胞与角膜上皮细胞特征相似，亦可以用于构建角膜样模型。

现如今，无论是角膜上皮细胞还是口腔黏膜上皮细胞的培养大多是参照皮肤KC的培养技术，早期多采用有血清培养基和组织块法，血清成份占10-20%。Souhtgaet等综合分析了培养基中的各种成份对原代口腔上皮细胞生长分化的影响，研究发现含血清10%的培养基成纤维细胞生长明显，对正常的口腔上皮细胞造成严重的污染，影响口腔黏膜上皮细胞在医学领域的应用。随后许多上皮细胞的培养采用酶解培养法，即用胰酶和 DispaseⅡ酶酶解的方法分离上皮细胞，然后以3T3作为滋养层的技术来进行的，但由于滋养细胞的存在影响试验结果的分析。而且，许多研究者相信3T3细胞和人细胞共同培养有可能引起突变或异种蛋白对人KC的转染，强调在选择性手术中尽量不用滋养层培养上皮细胞。为了避免使用滋养层，人们发展了多种方法：如培养皿表面涂细胞基质成份；不同浓度的钙和各种生物提取物、促分裂物和微量元素的添加。Arehnolti Bdnslev应用含10%血清的无滋养层培养方法，上皮细胞可传代两次，细胞形成复层，培养基中的血清除了诱导细胞过度分化导致上皮复层化外，血清中不明蛋白的存在，对细胞的信号转导和细胞表面标志形成干扰，另外，培养基中牛血清可能含外源性污染物和其它慢病毒，对人有潜在的危险。

针对上述问题，许多学者正寻求和使用无血清培养基，目前已有商品化的无血清培养基如K-SFM和MCDB153。MCDB153是经过多次改善得到的一款角质细胞无血清培养基，但在细胞培养过程中表现出局限性，繁殖和扩增细胞的能力有限，研究发现如果角质细胞在MCDB153中生长至完全汇合，则快速地丧失其传代能力。另外无血清培养基缺乏通用性，一种无血清培养基只能做到为一种或少数几种细胞株设计或优化出高密度生长或高水平目的产物表达的培养基，而其他细胞在这样的培养基体系中并不能较好的增殖生长。